免疫电泳
实验概要
蛋白质是一种两性电解质，它同时具有游离氨基和羧基。每种蛋白质都有自己的等电点。在等电点时，蛋白质所带的正负电荷相等。在pH值大于等电点的溶液中，羧基解离多，此时蛋白质带负电荷，带负电荷的蛋白质在电场中向正极移动；在pH值小于等电点的溶液中，氨基解离多，此时蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。这种带电质点在电场中向正极或负极移动，就称为电泳。各种免疫电泳技术也都是基于这一原理设计而成的。
实验原理
免疫电泳是指利用凝胶电泳，结合免疫扩散，以提高对混合组分分辨率的一种免疫化学分析技术。相应的抗原、抗体相遇后，比例恰当时，即出沉淀线。由于样品的游动图型呈放射状向外扩散，相应血清呈直线状扩散，于是二者相遇形成的沉淀线呈弧状。该方法可用来研究：抗原和抗体的相对应性；测定样品的各成分以及它们的电泳迁移率；根据蛋白质的电泳迁移率、免疫特异性及其他特性，可以确定该复合物中含有某种蛋白质；鉴定抗原或抗体的纯度。
主要试剂
1. 电泳缓冲液：常用pH值8.6、离子强度为0.075mol/L的巴比妥缓冲液。
其配法如下：
巴比妥2.76 g
巴比妥钠 15.45 g
蒸馏水加至1 000 ml
先将巴比妥放于已盛有300ml蒸馏水的三角烧瓶中加热熔化，再加入700ml蒸镏水，并加入巴比妥钠，溶后即可使用。也可先将巴比妥溶于1 000ml蒸馏水中，然后再加入巴比妥。
2. 15%缓冲琼脂：称取琼脂粉15g放入100ml巴比妥缓冲液中，高压或煮沸溶化。
主要设备
1. 电泳仪：一般要求电泳仪的电压能为0～500V，而电流从0～100mA即可。
2. 电泳槽：电泳槽宜用闭合式，防止由于电泳过程中产热，而使其琼脂凝胶中水份过度蒸发。作为电泳板的白金丝，必须与电泳槽等长，而槽中的缓冲液必须充分盖过电极，量要足够。
实验步骤
1. 取玻片一张，做好标记，然后按下图式样放上细玻璃棒(70×2mm)1根；
2. 把已溶化的15%巴比妥缓冲琼脂浇注在玻片上，每张25ml～30ml。注意勿使玻棒全部埋入琼脂中，应露1/3，浇注时不要使玻棒移动；
3. 打孔加样，打孔(孔径1～2mm)，孔离玻棒不宜太远或太近，以4mm为宜，用毛细滴管把抗原滴入孔中，然后进行电泳；
4. 电泳，把琼脂板放入电泳槽的支架上，两端分别贴上用2～4层已浸透缓冲液的滤纸或滤布，同槽内的缓冲液架桥相连。滤纸的宽度要同琼脂板的宽度一致，不宜过窄或过宽。加样的端接负极，另一端接正极。电压按玻片长度3～6V/cm为准(也可按电流计算，即玻片宽度2～4mA/cm)，一块26×76cm的玻片，用42～45V的端电压，端电压是用万用电表测量琼脂板两端所得的实际工作电表压，并不是电泳仪表指针所示的电压。电泳时间为1～2h；
5. 加入抗体，电泳完毕，用柳叶刀沿玻璃棒两侧划开琼脂，取出玻棒(用小镊子取出)，即成为抗体槽，用毛细管滴加抗体，注意勿使抗体溢出；
6. 加毕抗体后，将琼脂板放入有盖浸有湿纱布的搪瓷盘中，置37℃恒温箱中扩散24h之后，取出，观察结果；
7. 染色，将琼脂板放生理水中浸泡24h，中间换液数次，取出后，用0.05%氨基黑10B染色5～10min，然后以1mol/L冰醋酸脱色至背景无色为止；
8. 保存标本的染色方法，取出琼脂板，浸泡于生理盐水中1～2天，以除去未起反应的蛋白质，再放置蒸馏水中脱盐4～5h，放固定液(60%酒精98ml、冰醋酸2ml)中2h，然后用绸布或滤纸打湿后，覆盖于琼脂板上，置37℃ 24h干燥后，再以蒸馏水打湿绸布，揭去。再放在氨基黑10B染色液(氨基黑10B 0.5g，1mol/L醋酸500ml、0.1mol/L醋酸钠500ml)或偶氮胭脂红染色液中染色10～30min，取出以5%～10%冰醋酸脱色，至背景无色为止，用水冲几次，吸干水分，保存备用。
注意事项
1. 免疫电泳法较他它电泳的优点在于具有特异性沉淀弧，即使电泳迁移率相同的组分也能检出，因此抗原数目可用独立弧来断定，缺点是免疫血清不能包括所有组分的抗体，其实这也是免疫化学方法的共性。
2. 在加入抗原时，为了观察方便起见，可于样品中加一滴电泳指示剂(聚蔗糖0.25ml，巴比妥缓冲液10ml，偶氮胭脂红0.05g)，这样便于随时掌握电泳的位置而决定结束电泳的时间。
3. 在观察免疫电泳结果时要注意，有些沉淀出现较早，消失很快。
4. 由于琼脂的质量与规格不同，将影响标定各抗原的位置。为此，最好用标准抗原或国际通用琼脂定位，作为鉴定时的参考指标。
