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中和实验-1

2020.9.14

中和实验是一种特异性和敏感性均很高的血清学实验。在体外,病毒可以被相应的特异性抗体中和而失去其感染性,通过单层细胞培养检验病毒的感染性是否失去的方法称为中和实验。
 
中和实验是以测定病毒的感染性为基础,所以该实验必须在动物,鸡胚或组织培养细胞等活性体内进行,必须选用对病毒敏感的细胞,动物或鸡胚为材料,根据实验的不同目的设置严格的对照实验。
 
中和实验的主要应用是:
 
1 鉴定病毒:中和实验具有很高的特异性,利用已知型别的免疫血清与未知病毒做中和实验,如被中和,不但可以定量,而且可以定性。
 
2 可以用于分析病毒的抗原性。
 
3 测定免疫血清的效价和疫苗免疫后的抗体反应。
 
4 测定血清中的抗体滴度,用于诊断病毒性疾病。
 
[原理] 特异性的抗病毒免疫血清——中和抗体与病毒作用,能够抑制病毒对敏感细胞的吸附、穿入和脱壳,从而抑制了病毒的增殖,使 病毒失去感染性,中和实验常用有两种方法:一种是用已知病毒检测被测血清中的抗体效价,另一种是用已知免疫血清鉴定病毒型别。
 
一 )中和实验方法一——用已知病毒检测被检血清中的抗体效价
 
1 材料

1 )病毒悬液:选用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒液各 1.5ml 。使用前用 Eagle 维持液稀释至 100TCID50/0.1ml 含量( TCID50 即能使 50% 组织培养管发生细胞病变的病毒量)
 
2 )待检血清;用前 56 ℃ 30 分钟灭活,以除去非特异性抑制物
 
3 )敏感细胞:需长成单层,一般需 2-4 天,根据细胞种类和繁殖程度确定,本实验选用 Hela 细胞培养管 40 只。
 
4 )灭菌 Eagle 维持液、灭菌小试管 15 只、灭菌 1ml 吸管, 37 ℃水浴箱, 37 ℃ 5%CO 2 培养箱和显微镜。
 
2 方法

a 实验组实验方法( 1-5 号管)
 
1) 稀释血清:取 15 支灭菌试管,分成三排,每排 5 只分别编号。将待检血清用 Eagle 维持液从 1 : 5 按四倍递增稀释到 1:1280, 稀释后的血清每管 0.25Ml.
 
2) 在第一排各试管内,每管加入Ⅰ型病毒液 0.25ml ,第二排各试管内,每管加入Ⅱ型病毒液 0.25ml ,第三排各试管内,每管加入Ⅲ型病毒液 0.25ml ,加完后摇动试管架充分混匀,置 37 ℃水浴箱 1 小时取出。


3) 取 30 只 Hela 细胞培养管,弃去培养液,在每支培养管中加入上述病毒与血液混合液 .0.2ml ,每份混合液接种 2 支细胞培养管。接种后,培养管置于 37 ℃水浴 1 小时取出,于每支培养管内加入 0.8mlEagle 维持液,送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱培养。
 
b 实验对照组实验方法
 
1 )病毒对照组(6号管)
 
取 6 只 Hela 细胞培养管,弃去培养液,每支试管中加病毒液 0.1ml ,每型病毒液各接种 2 只培养管。然后送 37 ℃水浴保温 1 小时取出,于每支培养管中加入 0.9mlEagle 维持液,送 37 ℃ 5%CO 2 培养箱 培养。
 


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