分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

Ƴ干扰素释放试验临床应用的价值、问题与展望

2019.12.22

根据最近两次的结核病流调看，我国目前结核病疫情和结核分枝杆菌感染的情况呈现两个特点。首先，我国的潜伏结核感染率为44.5%-50.2%（用PPD试验检测），应用ELISPOT方法检测的LTBI率为15.4%-30.7%；其次，临床结核病患者中有85.6%的活动性肺结核是菌阴患者。由此可见，潜伏结核感染和菌阴结核病的诊断和鉴别诊断是当前我国结核病防控工作的面临的重大难题。近年来，Ƴ干扰素释放试验作为一种新的细胞免疫检测技术已用于临床检测，以下是对该技术在应用中出现的问题进行阐述，并对其应用前景作出展望。

IGRAs在临床应用中存在的问题

一．对基于IGRAs的两种技术原理ELISA及ELISPOT缺乏了解

ELISPOT技术是在单细胞水平上检测IFN-Ƴ的分泌情况，即检测单个细胞分泌IFN-Ƴ的能力和分泌IFN-Ƴ的细胞频率，结果直观、清楚，重复性好，可直接反应机体的细胞免疫能力。ELISA方法是在群体细胞水平检测IFN-Ƴ的分泌情况，重点检测IFN-Ƴ的生成量，只是间接反应机体的细胞免疫功能。

二．IGRAs检测结果的临床意义

IGRAs阳性说明存在Mtb感染，临床上可用于LTBI的诊断、菌阴结核病的辅助诊断及鉴别诊断，但不能区分潜伏感染和活动性结核。此外，机体的反应存在较大的个体差异，受机体的免疫状况影响，也受疾病类型影响，存在假阳性和假阴性的问题。对于免疫功能低下、合并HIV感染、血液病、器官移植和使用免疫抑制剂的结核患者，ELISPOT方法由于不受患者外周血淋巴细胞数目的影响，较ELISA方法能更客观、准确的反映机体对Mtb特异性的免疫功能，敏感性高于ELISA方法和PPD实验。

三．非血体液标本的检测

因为目前的检测流程及cutoff值不适用于非血液标本，并且患者例数少，商品化的IGRAs试剂盒用于检测非血液标本尚需进行大样本量研究。

四．质量控制

Ficoll的质量关系到PBMCs的回收率；PHA易失效，应关注；保证无菌操作。此外，重组表达的抗原纯度要在90%以上以避免假阳性。

五．两种IGRA方法对人员的要求

ELISPOT方法有一定的技术难度，特别是细胞分离、计数以及形成斑点的细胞准确计数是检测的关键环节，对人员要求较高，较难实现高通量检测，但其结果直观、清楚、重复性好，适用于临床检测。ELISA方法成熟、操作简单，可实现高通量检测，但由于干扰因素太多，尤其是时间和温度的影响最大，导致板与板间吸光度值差异大，批内及批间重复性不好。

IGRAs实验在临床应用中还需深入探讨的问题

一．IGRAs实验原理反应的一些基础问题

ELISPOT实验产生的斑点是结核特异性抗原刺激T细胞所形成的效应T细胞，还是效应T细胞分泌的细胞因子（如IL-2，IL-12）进一步诱导产生的效应T细胞，这种次级效应的强度有多大？是否是IGRAs实验假阳性的原因之一；目前认为ELISPOT实验得到的斑点代表效应T细胞，与机体的免疫功能直接相关，但1个斑点是否真的代表1个分泌IFN-Ƴ的细胞？斑点的大与小是如何形成的？有何意义；目前结核感染没有“金标准”，如何确定IGRAs的界限值以准确反映结核感染的真实情况。

二．PPD实验与基于两种方法学平台的IGRAs实验的相关性

IGRAs与PPD之间一致性差的原因分析：首先，PPD是多种分枝杆菌共同的抗原，所以理论上诊断结核感染的特异性差，而IGRAs方法的抗原是所有卡介苗菌和绝大多数NTM所不能产生的，对于像我国这样普种卡介苗的国家来说，能更有效的筛查结核感染；其次，PPD是一个体内实验，利用迟发型变态反应，通过激活记忆T细胞反应，检测潜伏、休眠的Mtb感染。LTBI者体内的Mtb是处于休眠期和复制期不定期转换，IGRAs实验只有当复制期时才是阳性，其测定的是效应T细胞而不是记忆T细胞。所以，这也有可能是PPD阳性率高于IGRAs实验的原因。
IGRAs-ELISPOT与IGRAs-ELISA一致性差的原因分析：首先，ELISPOT技术是在单细胞水平上进行检测，它的敏感性高于ELISA技术；其次，当LTBI者体内的Mtb真正处于潜伏、休眠期时，IGRAs检测结果呈现“假”阴性；此外，当LTBI者体内Mtb处于早期激活状态时，效应T细胞数目少，分泌IFN-Ƴ的能力低，这部分人群只有更灵敏的ELISPOT方法才可以检出；而当体内Mtb处于高度活跃状态时，两种方法检测的灵敏度相似。

三．IGRAs检测与患者临床状况的关系

IGRA-ELISPOT方法检测的斑点数或IGRA-ELISA方法检测的IFN-γ水平与结核病患者的关系还存在争议，目前的研究显示，当机体免疫功能正常时，斑点数越多或者IFN-γ水平越高，机体调动细胞免疫抗结核的作用越强，结核“活动性”感染或活动性结核病的可能性越大。这些现象与机体的免疫状况密切相关，但与结核病的严重程度不一定有关系，于体内Mtb载量是否相关尚需进一步的研究。活动性结核患者的IGRAs检测多为阳性，经过治疗，体内Mtb被杀灭或受到抑制，抗原分泌减少，诱导的细胞免疫应答降低，此时，IGRAs检测结果可由阳性转为阴性。

四．卡介苗接种对IGRAs检测的影响

理论上卡介苗接种不影响IGRAs检测的特异度。对于普种卡介苗国家进行LTBI者的筛查及结核病的防控具有现实意义。

五．肿瘤对IGRAs检测的影响

研究显示，15%的胸部肿瘤ELISPOT会出现假阳性；其它有报道指出肺癌患者中T-SPOT.TB的假阳性率为27.3%，而用ELISA的方法检测肺癌和肺炎的假阳性率分别为50%和29.3%。原因可能是肿瘤合并结核感染，

六．PPD实验和IGRAs检测阳性患者未来发展为活动性结核病的风险评估

目前的研究显示，无论是PPD实验强阳性者还是IGRAs阳性者未来发展为活动性结核病的只是少数，鉴于结核感染者未来是否发病存在个体差异，受诸多因素影响，因此，结核发病高危人群的筛查仍是需要重点攻克的难关。

展望

有必要对细胞刺激抗原做进一步的分析、筛选、比较、制备，以获取高效、特异的纯化抗原。
了解结核感染的不同时期，如Mtb感染休眠期、Mtb感染增殖期、结核病非活动期、结核病活动期、耐药结核病、肺外结核病的抗原结构、功能及表达情况，发现新的不同时期的分子标志物，以鉴别结核感染和发病。
多种细胞因子联合检测以提高检测的敏感度。

另外，应建立新的免疫诊断体系及评价体系、加强实用性免疫检测仪器的研发等。

Ƴ干扰素

互联网

喜欢作者我要约稿