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核酸活性多肽及递质的提取方法

2019.3.05

核酸分为两大类：一类为核糖核酸（RNA），另一类为脱氧核糖核酸（DND）。核酸的分子量极大，人数万致亿万。核酸是两性化合物，在一定的等电点。溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有机溶剂。细胞内的核酸常和蛋白质结合成核蛋白。核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白在不同浓度的电解质溶液中的溶解度有显著区别，有一定浓度范围的氯化钠溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度随着氯化钠浓度增加而逐渐下降，当氯化钠浓度为0.14mol/L时，其溶解度仅为水中溶解度的1/100，但当氯化钠浓度再增加时，脱氧核糖核蛋白的溶解度重新增加，氯化钠浓度增加到0.5mol/L时，其溶解度与水中溶解度相似，当氯化钠浓度增加到1mol/L时，它的溶解度比在水中大2倍。核糖核蛋白在0.14mol/L氯化钠溶液中仍有相当大的溶解度，因此常用0.14mol/L氯化钠溶液提取核糖核蛋白，而提取脱氧核糖核蛋白时，则用1mol/L氯化钠溶液。两种核糖核蛋白的溶解度与溶液的pH也有关。当pH为4.2时，脱氧糖核蛋白的溶解度zui低，而pH为2.0～2.5时，核糖核蛋白的溶解度zui低。所以调节氯化钠溶液的浓度和pH值，可使核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白分离开来。

　　（1）RNA的提取：RNA在细胞中主要有三种类型，即rRNA（核微粒核糖核酸）、tRNA（转移核糖核酸）和mRNA（信使核糖核酸）。mRNA代谢极不稳定，提取时要求条件较严格；tRNA当细胞破碎后，用酸处理得到“pH5”沉淀，即可从中分离tRNA；rRNA占全部RNA的80%以上，比较稳定，一般提取的大分子RNA主要为此部分。核内rRNA常先将细胞核分离后，再进行提取，可避免其他细胞组分RNA的干扰。
　　RNA的提取，通常是用0.14mol/L氯化钠溶液将组织做匀浆并反复提取细胞质中的核糖核蛋白，而留下含有DNA的细胞核物质，然后用10%醋酸调至pH4.2沉淀，离心弃去上清液，先用0.5mol/L氯化钠溶液，后用水洗涤沉淀，将核糖核蛋白后溶解于0.5mol/L碳酸氢钠溶液中，离心，取上清液，调pH至4.2,沉淀以0.5mol/L氯化钠溶液洗涤，再一次除去脱氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中的蛋白质可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去，核酸留在碳酸氢钠水溶液中，加入乙醇，RNA即以钠盐形式沉淀出来。
　　提取RNA另一类方法，不须事先用0.14mol/L氯化钠提取核糖核蛋白，而一步将RNA的蛋白质分开，并同时把RNA抽提出来，此类方法是在破碎细胞做成匀浆时，加入去污剂十二烷基磺酸钠或二甲苯磺酸钠；而现在zui常用的方法是直接加入含水苯酚与匀浆一起振荡，DNA和蛋白质沉淀于酚层中，水层中含RNA和多糖，然后用乙醇使RNA沉淀，四种物质一步便可初步分离开。苯酚法是目前提取不降解的RNAzui有效的方法，其应用举例如下：
　　肝脏rRNA的提取：按肝重（鲜）加入10倍容积苯酚-甲酚混合液（500g苯酚及70ml n-甲酚于50ml蒸馏水中，另加入0.5g 8-羟基喹啉配成）及10倍容积的0.5%萘-1，5-二磺酸水溶液（g/V）做匀浆后在20℃搅拌20min。
　　肝脏细胞核内mRNA的提取：先分离细胞核，再将核悬浮于3倍容积的0.5%pH6.5的萘二磺酸水溶液（g/V）中匀浆后加入等量90%（g/V）苯酚水溶液（内含0.1%8-羟基喹啉）在2℃振荡提取30min。
　　酵母tRNA的提取：100g酵母（湿重）加入200ml水，300ml 90%苯酚水溶液，振荡2h,4℃冰箱中过液，使之提取完全。
　　以上介绍了用冷酚法提取各种RNA的一些实例，近来还有皂土酚法（即除苯酚外还加入皂土吸附蛋白质）提取RNA，据报道比普通酚法提取RNA的生物活性高10倍左右。但应用苯酚法提取核酸时，须注意市售苯酚常含有少量重金属和杂质，可能导致核酸降解，使用时，一般需要减压重蒸。

　　（2）DNA的提取：DNA主要存在于细胞核中，天然状态的DNA绝大多数是以脱氧核糖核蛋白形式存在。人细胞中提取DNA时，一般先获得脱氧核糖核蛋白，再将蛋白质除去，从中分离DNA。常用的方法是以1mol/L氯化钠溶液抽提，得到的脱氧核糖核蛋白溶液与含有少量辛酸或戊醇的氯仿一起振荡，除去蛋白质。或者在组织细胞破碎后以低浓度0.14mol/L氯化钠溶液（也可用0.1mol/L氯化钠加0.05mol/L柠檬酸代替）反复洗涤除去核糖核蛋白，再以1mol/L氯化钠提取脱氧核糖核蛋白，提取仍按氧仿-戊醇抽提法除去蛋白质。两种方法比较，后一种方法使核酸降解可能少一些。以稀盐溶液提取DNA时，加入适量去污剂更有助于蛋白质与DNA的分离。
　　应用苯酚法也可以提取DNA而且不用经过脱氧核糖核蛋白这一步骤，例如大鼠肝匀浆在6%对氨基水杨酸盐溶液内，加入同体积90%苯酚水溶液，室温下提取1h，再经进一步提纯可获得98%～99%纯度的DNA。苯酚法也是目前提取DNAzui常用的方法之一。

　　（3）活性多肽及递质的提取
大体上与蛋白质的提取方法相似，可参照进行。经典神经递质如去甲肾上腺素、肾上腺素、乙酰胆碱、5-羟色胺等均可化学合成，无需用很多精力去提取。

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