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质谱沙龙第二十期活动报道

2009.7.02

　　2009年6月28日下午，质谱沙龙第二十期活动在北京师范大学分析测试中心举行。来自发酵研究院、二炮总医院、空军总医院、中科院植物所、AB公司、岛津公司、北京大学分析测试中心的各位专家、学生20余人。

　　第二十期质谱沙龙活动现场

　　北京师范大学分析测试中心简介及应用经验介绍

　　来自北京师范大学分析测试中心的谢孟峡教授，先向大家介绍了北京师范大学分析测试中心和成立不久的质谱中心。

　　北京师范大学分析测试中心谢孟峡教授

　　北京师范大学分析测试中心成立于上世纪八十年代，主要有三方面的工作任务分别是科学研究、教学和分析测试服务。现有固定工作人员30名左右，其中约40%具有博士学位，高级职称人员占50%以上;1994年通过国家计量认证，2003年在高校率先实现质量体系转换。

　　分析测试中心大型仪器设备主要分为光谱类、微区分析和表征类、核分析类、质谱中心和高性能科学计算中心这几部分。该测试中心主要服务于教学科研工作，打造学校实验的公共平台。

　　质谱中心和高性能科学计算中心成立于2007年10月份，现挂靠于北师大分析测试中心。质谱中心的管理运行模式是各院系之间分散放置、统一管理。目前质谱中心有包括气相色谱-质谱仪、液相色谱-质谱仪、同位素质谱仪等7台质谱，今年计划再添置4台。

　　质谱中心是新医药学科建设的重要研究平台之一，现代质谱技术在中药品质性效用的研究、现代中药创制的各个环节发挥着不可替代的作用。北师大质谱中心主要开展的工作重点包括：中药活性组分的定性定量分析、药物代谢机理及代谢动力学的研究、蛋白质及生物大分子鉴定以及代谢组学研究;还涉及质量控制与质量标准研究、药效学评价、药物于生物大分子相互作用等领域的研究工作。

　　《签字笔墨水燃料降解机理的研究》

　　在质谱应用经验方面，由分析测试中心王晋老师向大家介绍了课题较新颖的《签字笔墨水燃料降解机理的研究》报告。

　　北京师范大学分析测试中心王晋老师

　　2002年11月18日，某城市一起经济纠纷案中被告的一张借款收据，收据的落款时间为1999年12月9日，原告提出真正的落款时间为1999年 2月9日。“12”还是“2”孰真孰假?问题的焦点就在这个“1”是什么时候写上去的?最后法医人员借助了HPLC的力量，分析出“1”是后添加上去的，因此判原告胜诉。

　　王晋老师从真实案例入手，道出了笔迹书写时间鉴定的意义。

　　他们的课题组从2005年开始，长期收集签字笔的自然老化样本，并建立了一套方法，

　　用HPLC和LC/MS来进行笔迹老化规律及染料降解机理的研究。目前在国际上，该课题组的研究都处于领先地位。发表的相关文献为：

　　Studies on the degradation of blue gel pen dyes by ion-pairing high performance liquid chromatography and electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography, A (2006), 1125(1), 95-103.
　　Classification and dating of black gel pen ink by ion-pairing high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography, A (2006), 1135(1), 57-64.

　　王晋老师的工作是：选择20支具有代表性的黑色签字笔，从2005年1月31日至今长期收集这20支签字笔的自然老化样本，浸泡提取后应用HPLC方法和LC/MS方法进行笔迹老化规律及染料降解机理的研究。

　　研究路线如图所示。

　　研究路线图示

　　在HPLC笔迹老化规律研究方面

　　HPLC流动相选择了四丁基溴化胺作为离子对试剂，可以使墨水中的染料组分有效分离。在此基础上，根据色谱峰数目、保留时间等因素将签字笔墨水分为八类。研究各类签字笔笔迹在自然老化条件下的染料组分变化规律，以及与字迹形成时间的关系。老化实验研究结果表明，不同类别的签字笔墨水组分随老化时间都发生了明显变化，呈现出各自特征的变化规律。部分签字笔墨水在自然老化条件下染料组分迅速分解产生新的组分，新组分的相对含量随老化时间延长而迅速增加。从实验结果可以看出，样品经长期自然放置后，随老化时间发生明显变化，且变化方向有规可循;可依次建立研究方法，为推断签字笔字迹的形成时间提供科学依据。

　　在LC/MS染料降解机理方面

　　根据各墨水组分自然老化结果，选择不同老化规律的三类签字笔墨水，分析其染料成分发现：第一类墨水I24中含有染料Direct Yellow 7;第二类墨水I22中含有染料Acid Violet 49和Acid Blue 9;第三类墨水I29中含有染料Acid Red 52和Diret Black 19。在染料降解机理探讨过程中发现：第一类墨水中的Direct Yellow 7变化较为明显，在自然老化条件下就能发生明显的降解过程;第二类墨水中的Acid Violet 49结构较为稳定，不易在自然放置过程中发生变化，但经光老化后却能生成较多的降解产物，且在日光灯老化条件下降解程度比在紫外灯老化条件下更为明显;第三类墨水中的Acid Red 52在自然和人工老化过程中都能发生降解，生成新组分，但人工老化降解趋势和程度都更为显著;而Direct Black 19在人工老化过程中并未发生组分含量变化，也未能发现新组分的生成，说明其结构十分稳定，并不随老化条件而发生变化。王晋老师重点介绍了第三类墨水的研究过程。

　　该研究为签字笔字迹形成时间的判定提供了有力的科学依据，为墨水染料降解机理的研究建立了可行的实验方法。该课题组长期积累的大量样本和数据，以及持续不懈的研究，将为“笔迹时间鉴定”这类涉及案例众多、难判的“官司”提供愈来愈多、愈来愈可靠的科学证据。

　　报告后的提问中，在座专家询问利用光谱技术如红外光谱是否能够进行上述的检测，谢孟峡教授指出红外光谱的灵敏度不够高，另外没有经过色谱分离，抗干扰能力和分析特异性都不及液相色谱和质谱。

　　本网收录前沿Lab：北京师范大学分析测试中心

　　用电喷雾质谱研究四链体DNA的形成、稳定性及其构象

　　来自北京大学化学学院分析测试中心的周江博士，为大家做了题为《用电喷雾质谱研究四链体DNA的形成、稳定性及其构象》的报告。

　　北京大学化学学院分析测试中心周江博士

　　富G序列存在于许多重要的DNA片段中，特别是端粒DNA中。端粒是染色体末端一类特殊的结构，它是由富含鸟嘌呤的重复序列构成。人类端粒DNA含有大量TTAGGG重复单元，除了其2-10kb的双链部分外，还有约200b的单链部分。近年来发现，这部分单链富G序列可以在阳离子(如K⁺、Na⁺等)的存在下自我缠绕折叠形成G-四链体的结构，G-四链体是由G-四分体堆积形成的，每个G-四分体则是由一个平面上的四个鸟嘌呤所构成，每个鸟嘌呤都同时作为碱基对氢键的给体和受体。由于这种四链体的结构极有可能影响某些功能蛋白(如端粒酶)的结合位点，考虑到端粒对DNA结构的稳定作用及抗癌性，所以研究人体端粒DNA四链体的形成、性质及小分子结合性对于抗肿瘤药物的设计有着深刻的意义。

　　G-四链体结构图

　　质谱仪器采用Thermo公司的Finnigan LCQ Deca XP plus，离子传输管温度设为100°C，喷雾电压为2kV，Sheeth Gas设为20arb，采用2 μL/min的直接电喷雾方式。

　　第一部分，本研究首先用电喷雾质谱法研究了6碱基XGGGGX四链体DNA的形成规律，发表于Chem. Eur. J. 2007, 945-949上：

　　选择的靶点为一种原生动物的端粒序列，其重复序列为TGGGGT标记为Q(1)，选择相似A、C作为不同的末端分别标记为Q(2)和Q(3)，四链体结构中间配有一定的阳离子(NH4⁺，用NH4⁺是因为对质谱比较友好)辅助配位，单链的富G序列可以在阳离子的存在下自我缠绕折叠形成G-四链体的结构。可能与该四链体结构相互作用的分子选择了一个寡聚酰胺分子ImImImβDp和一平面分子Tel01。

　　1、在加入NH4⁺离子的情况下，15个含6nt寡聚核苷酸，只有XGGGGX才能够形成四聚体峰，并且稳定性为Q(2) > Q(1) > Q(3)，这与分子模拟计算的结果一致。

　　2、对于XGnX的序列，可以得到“n-1规则”：四聚体中心NH4⁺离子的个数总是G-平面的个数减1。

　　3、小分子与Q(1)的结合强弱顺序为：Tel01 >> ImImImβDp。Tel01相对寡聚酰胺分子有着更强的结合。对于Q(2)和Q(3)序列，得到了类似的亲和性大小关系。

　　4、改变质谱的温度条件，可以得到四聚体解链的温度。小分子与四聚体结合后，起到了稳定化的作用，并且结合越强，解链温度越高。且对于同一个小分子，几个四聚体的稳定性顺序为Q(2) > Q(1) > Q(3)。

　　第二部分，用电喷雾质谱研究了人类端粒DNA四链体，发表于Chem. Eur. J. 2007, 5018-5023：

　　选择人类的端粒作为目标DNA，其重复序列为TTAGGG，选择两个重复的TTAGGG及其互补链即TTAGGGGTTAGGG/CCCTAACCCTAA形成的双链结构标记为D,选择四个重复的AGGGTT序列形成的四链体结构标记为Q。选择ImImImβDp(标记为III)、PyPyPyγImImImβDp(标记为T6Y)和Tel01作为其结合分子。

　　1、人类端粒四聚体DNA与小分子的结合亲和力顺序是：Tel01 > ImImImβDp >> PyPyPyγImImImβDp。这与小分子本身的结构及结合模式有关系。

　　2、在模拟人体内同时存在双链与四聚体DNA的情况下，本研究发现：小分子ImImImβDp对二者没有特殊的选择性，PyPyPyγImImImβDp对双链DNA有特异的选择性，而平面分子Tel01对于四聚体DNA有特异的选择性，这种选择的特异性对今后在研究药物寻找靶点的方向上有很大的帮助。这是首次在同一个体系中检测到小分子与多个DNA的特异选择性结合。

　　3、人类端粒DNA在纯水中，(AGGGTT)4序列的构象主要是以单链为主，加合峰、电荷较多;加入Tel01分子后，构象以收敛的四聚体为主，电荷、加合峰较少。CD的结果验证了这个结论，且平面分子Tel01使得(AGGGTT)4序列转化为反向平行的四聚体结构，说明反向平行构象更利于与Tel01结合。

　　4、退火(把双链DNA加热至90°C 保持10min，慢慢冷却至室温)对于这种长链形成的四聚体DNA与Tel01的结合有着很大的影响，退火前在NH4Ac中，Tel01与(AGGGTT)4序列有很强的结合，而退火之后结合峰变弱。CD结果同样显示，在NH4⁺离子存在下，退火前构象为反向平行，退火后为正向平行，而Tel01分子更易与反向平行构象结合，所以退火前的构象更有利于与平面分子Tel01结合。

　　5、在纯水中引入NH4⁺和K⁺离子后，质谱和CD的结果都表明四聚体结构大大增加，说明中心阳离子对于稳定和维持四聚体结构具有重要的作用。

　　本网收录前沿Lab：北京大学分析测试中心

　　报告下载：《用电喷雾质谱研究四链体DNA的形成、稳定性及其构象》

　　LC-MS/MS高通量定量分析的平台——DiscoveryQuant^TM软件

　　最后由自来AB公司的张克荣工程师向大家介绍的报告为《LC-MS/MS高通量定量分析的平台——DiscoveryQuant^TM软件》。

　　AB公司张克荣工程师

　　AB公司推出的DiscoveryQuant^TM软件主要为药物开发工作提供了一个高通量定量分析的平台。药物开发一般分为药物发现、临床前实验、药物发展及生产制造这四个阶段，在药物开发阶段的定量和定性分析上都有严格的法规要求贯穿始终。近年来国家对仿制药管理越加严格，促使国内大量药厂也积极投入到药物发现阶段。该阶段需要在大量的化合物中进行筛选、工作量很大，而DiscoveryQuant^TM软件为该阶段工作提供了一个快速筛选的平台。

　　早期药物发现阶段工作的两个关键问题首先是优化分析方法，找到最理想的LC/MS/MS方法;其次则是对筛选出的药物进行大批量的测定工作。

　　AB公司在2007年首次将DiscoveryQuant^TM软件提供给用户使用，该软件最初是同辉瑞制药的合作研究成果，目前已普遍应用于全球的大型药厂。

　　DiscoveryQuant^TM软件分为方法优化和样品分析两个分析步骤。方法优化可以快速调机和灵活查看结果，每天可完成100个化合物以上的方法优化;样品分析可将优化的方法快速移植到大批量分析，从而完成早期药物发现阶段的高通量筛查。

　　分析方法的优化

　　该软件的工作流程首先选择实验类型，在方法建立初期首先进行Q1扫描来找到化合物的分子离子峰，在该过程中可对该化合物进行DP(Declustering Potential)优化，优化后给予能量并打碎，一般串联质谱定量分析采用MRM的方法，第一步对其母离子进行全扫描，在该化合物合适的情况下再进行二级MS/MS分析，之后对其能量进行优化，优化结果将放到数据库里，最终实现全自动、高通量的智力工作流程。

　　优化之后满足条件的化合物存储到数据库里，该数据库可以全球共享，使用于多个实验室之间。数据来源可从当地数据库或全球数据库里进行选择，只须提供化合物的分子量该软件就会自动进行优化，在优化的过程中可以定义一些强度、质量数的预知，在寻找母离子时可提供偏差数据从而缩小操作范围。在条件设定的过程中，可设定优化对Q1扫描相关的质谱参数进行扫描。在优化过程中可以随时使用暂停键审查Q1全扫描数据质量，然后再开始子离子扫描。

　　优化结果面板将会显示符合条件的化合物数量，优化出的最佳条件，优化后的DP参数和CE参数。

　　张克荣工程师指出经过反复实验验证，人工优化与DiscoveryQuant^TM软件优化结果是相同的。该数据库存贮了每一个化合物的优化方法，对以后进行渗透性、传输性、稳定性的研究提供了有效地信息。

　　样品的分析测定

　　在样品分析步骤中，该软件可对几个或几十个化合物同时进行分析，对优化后的化合物该软件利用cassette功能，通过设定一些限定条件便可将这些化合物进行分组，可自动生成样品列表。由于化合物数量大，该软件也可根据实验日期、内容设定样品的名称，以便利于分析查看。

　　DiscoveryQuant^TM软件特色