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一种用于检测和定量分析细胞代谢物的HILIC LC-MS方法

2020.3.18

引言

复杂生物样品通常包含大量可反映有机体代谢状态的内源性代谢物。特别是骨骼肌可根据其是快收缩肌(白色肌肉，糖酵解型)还是慢收缩肌(红色肌肉，氧化型)而表现出特征性的代谢组“指纹图谱”。例如，红色肌肉应显示一种富含线粒体代谢物(如三羧酸循环)的代谢组指纹图谱;而白色肌肉应显示富含糖酵解代谢物的代谢组指纹图谱，其线粒体代谢物的浓度大大低于红色肌肉。虽然很多这类代谢物可具有较强的极性，但这些样本通常使用反相液相色谱-质谱(RP-LC-MS)进行分析，由此而来的多是较差的保留。在本研究中，我们开发了一种用于检测和定量强极性细胞代谢物的新颖LC-MS方法。本研究采用了基于亚2微米颗粒BEH酰胺柱的亲水作用液相色谱(HILIC)，并联用了杂化四极杆飞行时间质谱仪和三重四极杆质谱。

方法

这些试验借助联用了沃特世SynaptTM HDMSTM、沃特世Synapt G2 HDMS和Xevo TQ的一台UPLC系统而进行：

液相色谱条件

(1)：使用碱性流动相液相色谱系统：沃特世ACQUITY UPLC®系统 - 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1×100mm，1.7µm - 柱温：45℃ - 流速：500µL/分钟 - 碱性流动相A：乙腈/水，95/5(v/v)，10mM醋酸铵，pH=9.0 - 碱性流动相B：乙腈/水，50/50(v/v)，10mM醋酸铵，pH=9.0 - 梯度(采用碱性流动相进行分离时)：线性梯度，先用2% B - 85% B洗脱8分钟，然后在98% B的水平下保持2分钟，接着返回到2% B的水平进行再平衡(5分钟) - 进样量：5-20µL

液相色谱条件

(2)：使用酸性流动相液相色谱系统：沃特世®ACQUITY UPLC®系统 - 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1×100mm，1.7µm - 柱温：40℃ - 流速：600µL/分钟 - 酸性流动相A：乙腈/水，95/5(v/v)，10mM醋酸铵，pH=3.0 - 酸性流动相B：水，10mM醋酸铵，pH=3.0 - 梯度：先用5% B - 30% B洗脱5分钟，在第5.5min时升至60% B并保持7分钟，接着返回到5% B的水平进行再平衡(5分钟) - 进样量：20µL满定量环

质谱分析 Synapt HDMS和Synapt G2 HDMS 该质谱仪在正离子MSE模式下运行。所用的毛细管电压为3.0kV，源温度和去溶剂化温度分别被设定为120℃和400℃。在MSE采集模式下，仪器交替在低、高碰撞能量状态下进行交替扫描。这样可在一次分析内同时收集所有分析物的母离子和碎片离子的信息，消除了诸如DDA等其它常规方法所带来的采样偏差;在常规方法中，特定的m/z必须在碎片化前被分离出来。 Xevo-TQ质谱 Xevo TQ可同时在正离子和负离子模式下运行。毛细管电压为3.0kV，源温度和去溶剂化温度分别被设定为150℃和650℃。去溶剂化气体流速被设定为1200L/小时，碰撞气体(氩)的流速为0.18mL/分钟(4×10-3毫巴)。MS1/MS2分辨率被设置为单位质量(0.75Da FWHM)。

组织提取物的样品制备红色的比目鱼肌(S)用来与白色的腓肠肌(G)进行比较，肌肉从禁食一整夜的BALB/c小鼠中切下并进行了急速冷冻。代谢物通过组织均质化的方法在 1:1的甲醇：水混合溶剂中进行萃取，脂质通过将氯仿以1:1的比例添加至甲醇/水萃取液中而得到去除。去脂质后的组织萃取样本分别用400µL和 4000µL的90:10乙腈：水混合溶剂进行挥干复溶。由于某些组分的含量高于定量上限，因此也对每份样本再稀释10倍进行了分析。

结果和讨论

1. 通过联用Synapt HDMS的UPLC进行HILIC LC-MS方法开发

1. 108种标准强极性细胞代谢物的总离子色谱图，其中包括氨基酸、DNA/RNA碱基及其磷酸盐、辅酶A、B族维生素、有机酸等。

图1给出了108种标准强极性细胞代谢物的总离子色谱图(TIC)，其中包括氨基酸、DNA/RNA碱基及其磷酸盐、辅酶A、B族维生素、有机酸等。此项试验通过联用沃特世Synapt HDMS(正离子MSE模式下)的沃特世UPLC【液相色谱条件(1)】而进行。

图2. 单一化合物提取离子色谱图示例(50mDa窗口内)

图2给出了关于单一化合物提取离子色谱图片段(50mDa窗口)的一些例子。所选取的提取离子色谱图中的大部分峰宽测定值介于5-15秒之间。然而，也观察到了拖尾峰，其峰宽长达60秒。因此，我们考虑修改液相色谱的条件。

2. 使用UPLC/Xevo-TQ联用仪器对HILIC LC-MS方法开发标准品和细胞萃取物进行定量分析在UPLC优化过程中进行的标准品分析表明使用酸性pH的流动相缓冲液可提高对氨基酸和有机酸的分辨率、信噪比和峰对称性。图3比较了对一种包含约 2µg/mL L-赖氨酸的纯氨基酸溶液所得出的两幅MRM色谱图。靠上的色谱图通过使用碱性流动相(液相色谱条件1)所进行的分离而得出，而靠下的色谱图则采用酸性流动相(液相色谱条件2)。

图3. 比较不同pH下，包含约2µg/mL L-赖氨酸溶液的两幅MRM色谱图

图4. 液相色谱条件(2)得出的MRM色谱图示例图4将酸性流动相(液相色谱条件(2))下1600ng/mL校准标准品(上图)和样本H-S(0090)的MRM色谱图进行了叠加。在此条件下，我们成功分离并定量分析了28种化合物，其中包括氨基酸、有机酸和磷酸盐(图6)。

图5. TargetLynx给出的ADP电子报告示例 .

图6. 使用碱性(左表)和酸性(右表)流动相在H-S和H-G组织样本中所检出化合物的浓度计算结果总合对在碱性和酸性流动相分离中所检出的H-S和H-G组织样本中的每种化合物均计算了分析物浓度。通过比较红色比目鱼肌(S)和腓肠肌(G)组织样本中的代谢物浓度证实了在其相对浓度方面存在显著差异。 3. 通过联用Synapt G2的UPLC对HILIC LC-MS方法的标准品和细胞萃取物进行定量分析最近开发的用于Synapt G2的QuanTof技术[1]以及MSE数据采集技术的应用实现了一种通用型UPLC-MS方法的开发;这种方法可在一次运行分析得到提供所有物质的定量和定性信息，既包括母离子信息也包括产物离子的信息。对于此项测定而言，系列稀释标准品以及H-S和H-G样本的数据都进行了采集(图7)，所有的数据处理工作在采集完成后进行。

图7. 全扫描色谱图比较。通过UPLC-Synapt G2获取的S和G细胞萃取物的数据。

图8. 目标化合物的鉴定和定量结果

首先，自动筛选细胞萃取物中是否存在目标化合物。离子的鉴定和确认通过一个单一处理步骤使用Posit±veTM软件包得出母离子和子离子的准确质量(2mDa窗口)而实现(图8)。该数据表明与Xevo TQ分析结果具有良好的一致性。图8给出了一个示例，化合物L-脯氨酸在细胞萃取物中被明确鉴别出来，并在4个数量级中表现出线性的动态范围响应，RMS 质量误差为0.57mDa。

结论 ·使用新型BEH Amide酰胺柱可开发出一种用于分离极性组织细胞代谢物的HILIC LC-MS方法，总运行时间不到15分钟。 · 同时采用Xevo TQ和Synapt G2 HDMS对红色和白色的肌肉组织萃取物进行定量分析，可明显区分出其主要代谢物(比如AMP、ADP和ATP、以及瓜氨酸)的显著不同。 · QuanTof技术实现了定性和定量试验能够在Synapt G2上同时进行。

定量分析细胞代谢物

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周锦帆