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昆虫细胞--高MOI杆病毒感染

2019.4.29

高MOI（ Multiplicity Of Infection，等于用于感染的病毒数目与细胞数目的比值）感染是生产蛋白的最好方法。这有两个原因。一是不用考虑DIP（Defective Interfering Particles，即只包装入部分基因组的病毒颗粒）的形成，因为关心的是细胞或者培养液中的蛋白；二是高MOI感染是最便于控制、重复性好的方法，以达到高的蛋白表达水平。

低MOI感染也可用于生产蛋白，但是难以控制，难以达到最高的表达量。然而病毒需要量少的确是该法的一个优点，对于大规模的生产这个优点极为有利，只要它们可以可靠的复制，这因不同的重组病毒而异。

一般说来，用高MOI感染的方法就是将培养液中所有的细胞同时感染，每个细胞至少感染一个病毒颗粒。这个过程的几率可以用Poisson分布来分析，简而言之，如果你想同时把所有的细胞都感染，MOI值应该接近3。由于一旦加入病毒细胞就不再生长，因此你可以精确的控制感染时细胞的密度，这个密度大约应该大约是平台期最大密度的一半。随着细胞株的不同，大约在1.5~2.5×10⁶细胞/ml之间。

重要的是培养液的量要满足细胞生长的需要，否则将没有足够的营养使细胞生产病毒或者蛋白。另一方面，病毒也不可以太多，以免在细胞增殖到合适密度并用掉所有营养资源之前就被杀死。用高MOI感染的方法，这些条件比较容易优化，只需准备密度变化在1~3×10⁶细胞/ml之间的一系列细胞培养物，以固定的细胞：病毒比例去感染细胞，筛选蛋白产量最高时的那个密度即可。

采用这个方法需要你使用足够量的病毒使细胞生长立即停止。病毒量可以通过进行一个小量实验来确定，先使细胞达到上面确定的最优密度，然后变化病毒的量确定感染率。高MOI感染的最大的缺点是需要准备大量的高滴度病毒，这个缺点在大量生产时尤为突出。例如，如果你的病毒不能形成高滴度的溶液，只能达到3×10⁷pfu/ml左右，你需要加相当于细胞培养物20%体积的病毒。如果细胞的密度为2.5×10⁶，体积为8升，那么为了得到密度为2×10⁶细胞/ml的被感染细胞，需要加入2升病毒！你的细胞必须能够生长到较高的密度--2×10⁶细胞/ml，并且保持对数期良好状态，你必须加入相当于终体积20%的培养液以达到最终体积，这是实验能够顺利进行下去的极限。

然而，如果你可以得到高滴度的病毒以满足感染的需要，这种方法的产量、可重复性非常高。因此，我建议在表达一个新的蛋白时，开始最好先试用这种方法。并且用这种方法得到的蛋白的产量可作为衡量其它方法（低MOI感染）产量的标准。尤其是当你的培养物体积小时（小于500ml），这是最好的方法。

步骤

将你的细胞以2~8×10⁵细胞/ml的密度分装到摇瓶或者搅拌器中，达到摇瓶体积的20~40%，记得留出一些空间以待于将来加病毒。当培养物的体积小于500ml时，我更喜欢用摇瓶。在27±2℃培养，转速为100~130rpm。

第0天

培养细胞至密度达到大约1.5~2.5×10⁶细胞/ml，即最大密度的一半。这可能需要多于1天的时间，与接种密度有关。

加入足够的病毒，以使所有的细胞被同时感染，但是避免加入的病毒体积多于终体积20%，最好不要多于10%。加入的量取决于病毒的滴度。

如果细胞的密度为2×10⁶细胞/ml，病毒的滴度为5×10⁷pfu/ml，要达到MOI值为3，需要加入12%体积的病毒。

将摇瓶放回27℃摇床，培养24小时。

感染后第1天

计数细胞，估计细胞大小。如果是在高MOI下感染，那么所有的细胞都已经被感染。它们与第0天比将不会在数目上增长，并且在细胞形态上显著膨胀。此时很容易看到细胞表面变得粗糙，这是病毒正在出芽的结果。

如果发现细胞数目有所增多，可能是由于对病毒滴度的估计偏高，使得细胞没有全部被病毒感染。这种现象在MOI值大于3时很少出现，因为一般的杆病毒噬菌斑实验结果通常是低估病毒的滴度。如果细胞数目的增长没有超过25%，可能只会影响最佳收获时间。平均每个细胞生产的蛋白量也会稍低。

感染后第2天

再次计数细胞，估计细胞大小。此时与第1天比细胞数目无论如何都不应该再增长。如果增长了，你的感染可能分布不均匀，很可能是病毒滴度低造成的。

此时细胞应该大大膨胀，细胞核占据了细胞的大部分空间。

此时可能是细胞或者培养液的时间了，这因不同的蛋白而异。大多数蛋白的产量在感染后48~72小时之间不会再有增长。不过这需要实验来确定。

感染后第3天

再次计数细胞，估计细胞大小。此时所有的细胞应该已经被彻底感染，细胞膨胀并且生长停止，否则就说明没有足够的病毒使细胞在达到平台期之前停止增长。收获培养物，离心分离细胞，将培养液避光保存于4℃，或者冻存于-70℃。

通常最好将细胞沉淀冻存。我喜欢的方法是将细胞重悬于小量（比如1/4体积）的PBS或者TBS（含有浓度为通常5倍的蛋白酶抑制剂）中，充分重悬后直接用微量移液器加入充满液氮的干净Dewar瓶中。滴下的重悬物遇到液氮迅速冻结形成小球，这些小球可以被分装到50ml圆锥管中，冻存于Revco冰箱中。当需要从细胞中纯化蛋白时，只需将这些小球逐个加入到3~5倍体积室温下不断搅拌的裂解缓冲液中，它们将很快融化，使缓冲液降至接近0℃。这些小球还可以用镊子方便的转移到eppendorf管中作小量实验。

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周锦帆