流式细胞仪检测细胞凋亡方法(Annexin V 法)
实验概要
Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，本实验介绍了一个用流式细胞仪检测细胞凋亡的方法(Annexin V 法)。
实验原理
Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V /核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V /核酸染料 )。
主要试剂
1. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。
2. Annexin V Binding Buffer缓冲液(Cat. No. 66121E)：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
3. Annexin V试剂与核酸染料：
Annexin V 核酸染料
Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X) PI(Cat. No. 66211E)或
Streptavidin-FITC(Cat. No. 13024D) 7-AAD(Cat. No. 34321X)
Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X) PI(Cat. No. 66211E)
Annexin V-PE(Cat. No. 65875X) 7-AAD(Cat. No. 34321X)
主要设备
1. 一次性12×75mm Falcon试管。
2. 微量加样器和加样头。
3. FACS流式细胞仪：上样检测。
4. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。
5. Annexin V检测对照管：
Annexin V A-阴性对照 B-补偿1 C-补偿2
Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin和SAv-FITC PI和SAv-FITC
PE 未染色细胞 Annexin V-PE 7-AAD
FITC 未染色细胞 Annexin V-FITC PI
实验步骤
1. 取Falcon试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。
2. 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1× Binding Buffer缓冲液制成1×106细胞/ml的悬液。
3. Falcon试管中加入100 μl细胞悬液。
4. 按以下体积加入Annexin V与核酸染料：
管号 名称 荧光标记Annexin V 核酸染料
1 阴性对照 - -
2 单阳1 AV-FITC -
3 单阳2 - PI
4 样本 AV-FITC PI
5. 轻轻混匀，室温(20°C ~25°C)避光处放置15分钟。
6. *使用Annexin V-Biotin试剂进行检测时：
1×Binding Buffer缓冲液洗细胞一次，去上清。
1×Binding Buffer缓冲液100μl溶解SAv-FITC试剂0.5μg，加入到细胞管中。
轻轻混匀。
加入5μl PI，室温(20-25°C)避光处放置15分钟。
7. 各试验管中分别加入1×Binding Buffer缓冲液400μl。
8. 1小时内上流式细胞仪测定结果。
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