细胞凋亡及其检测技术-2
（二）荧光法：
选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。
弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。
（三） DNA琼脂糖凝胶电泳法：
1、DNA提取：
用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。
分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。
于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。
冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。
上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。
吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。
加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。
加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。
2、琼脂糖凝胶电泳：
TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。
待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。
取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。
60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带，
（四）透射电镜形态学观察法：
收集药物作用后最佳凋亡时期的凋亡肿瘤细胞，细胞总量大于10^6个，用PBS洗2遍后用3%戊二醛固定1h，PBS洗2次，再用1%锇酸固定1h，丙酮酸梯度脱水。
细胞用树脂包埋，并进行超薄切片，用醋酸钠-枸橼酸铅染色，透射电镜下观察凋亡的细胞形态，可见有染色质浓集，不均匀分布，考核周边形成有核膜包裹的断裂核碎片，呈新月形凋亡小体，并选择典型切片图像摄影。
（五）流式细胞仪检测法：
1、原理：
处于增殖周期中的细胞，根据其所处不同周期时相其DNA含量分布在2n-4n之间，发生凋亡的细胞内与核内DNA裂解成许多小片断，用细胞膜通透法可使小分子量的DNA片断穿过薄膜而丢失，仅剩下大分子量DNA片断，这些失去部分DNA的细胞可形成一个DNA含量小于2n的分布区，称“亚G1峰”，即AO峰（凋亡峰）。
2、特点：
经济简便，仅需单一染色。
可判断凋亡细胞发生于哪一周期。
可定量测定凋亡率，结果客观可信。
用同样本可同时进行“亚G1峰”测定及DNA凝胶电泳。
3、方法步骤：
收货不同剂量药物作用于各不同时期的肿瘤细胞，细胞总数应大于10^6个，用PBS洗2次，加入70%酒精固定，4℃存放。
染色前用PBS离心沉淀去除固定液，并用PBS洗1-2次，加入200ulRNA酶，37℃水浴30min。
每毫升细胞悬液中加入碘化丙锭（PI）染液100ul混匀，置4℃避光30min，用流式细胞仪进行细胞周期分析，低于G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞。测定“亚G1峰”值和细胞凋亡率。
除上述常用的方法外，还可采用：
ELISA法。其凋亡的断裂核可与抗组蛋白抗体及抗DNA抗体混合物反应后形成双抗体“夹心”结构，再经酶显色也可判断。
末端转移的酶标记技术，利用核裂解碎片含有3/-OH的末端，在末端转移酶作用下加入已标记的核苷酸，在3/-OH末端上合成一段含标记的尾巴，再经酶显色或用荧光抗体显示出来。
五、bcl-2凋亡基因表达的检测
（一）原理：
细胞凋亡是一个受基因调控的主动过程，bcl-2是抑制细胞凋亡的原癌基因，正常细胞的激活和发育过程中都有表达，但在发育成熟的细胞中，其表达降低，在低分化或癌变的细胞中，bcl-2高表达与肿瘤的发生、发展相关，bcl-2过量表达常导致对化疗药物的耐药性而阻止细胞凋亡，影响治疗效果，一旦细胞发生凋亡，其bcl-2表达降低，甚至完全消失。
bcl-2家族由bcl-2、bcl-X、bax、mcl-1和A1组成。进行bcl-2基因表达的检测有两种，一种是用抗bcl-2蛋白抗体的流式细胞仪测定法，检测细胞浆中的bcl-2蛋白量，另一种是采用RT-PCR法测细胞中bcl-2 mRNA的表达。
（二）方法：
1、bcl-2蛋白表达的检测：
采用流式细胞仪和间接免疫荧光法测定细胞中bcl-2蛋白的量。
收集药物不同剂量、不同作用时间的凋亡肿瘤细胞，用含2%小牛血清的PBS洗2次。
加入2%多聚甲醛室温固定20min，再用PBS配制的Staing缓冲液洗涤。
1500r/min离心5min，弃上清，置-20℃存放过夜。
在冻存的细胞内加入1mlPBS配制的TB穿透液放置5min，用Staing缓冲液洗涤1次后，加2%灭活的人AB型血清1ml，37℃放10min。
加入bcl-2多抗工作液40ul，4℃孵育30min后，对照组不加多抗，随后用PBS洗3次，5min 1次。
加入FITC荧光标记的二抗工作液40ml4℃孵育30min后，用PBS洗3次，用流式细胞仪检测荧光强度（MFI）的变化，计算bcl-2阳性细胞表达率和bcl-2蛋白表达的平均荧光强度。
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