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方案7 二维色谱和质谱结合分离多肽混合物：离线方法

2019.3.29

实验材料	肽标准品可溶性酵母蛋白或其他复杂蛋白混合物胰酶
试剂、试剂盒	CaCl2 变性溶液透析液碘乙酰胺（IAA)反相色谱溶剂 SCX (强阳离子交换）色谱缓冲液三氟乙酸（TFA)
仪器、耗材	透析管金导线 LCQDECA 离子讲质谱仪微型四通毛细管分流器 RP 毛细管层析柱 SCX 层析柱 SEQUEST 软件
实验步骤	一、可溶性酵母蛋白的酶解 1.将 1mg 冷冻干燥的可溶性酵母蛋白加入0.5 ml 的变性溶液中，37°C 溶解 15 min。 2.加入 IAA 至终浓度为 50 mmol/L，然后将样品置于暗处 30 mm，室温条件下使半胱氨酸残基烷基化。 3.样品透析：将样品溶液在 100 ml 的透析液中室温透析 lh，以除去盐和低分子量物质。 4.更换透析液，重复步骤③两次。 5.向样品中加人 20ug 胰酶，37°C 孵育 lOmin。 6.用 10 mmol/L Tris-Cl(pH8.5) 将样品稀释 2 倍（至 1.Oml)，加入 CaCl2 至终浓度为 1mmol/L。用 pH 试纸验证 pH 值是否在 8 到 9 之间。若变性液中含 SDS(步骤①），则必须使其在样品液中的终浓度低于 0.1%，以便胰酶有效消化。 7.37°C 条件下胰酶消化过夜。 8.用 2ul 的 TFA 酸化样品以终止消化，用 pH 试纸确证溶液 pH 值低于 3。也可用其他方法来溶解（步骤①）和消化蛋白质（例如可不加 SDS，使用其他还原剂，若盐浓度很低则不用透析等）。不过在用 SCX 色谱进行多肽分离前，盐终浓度一定要低于 20 mmol/L(包括 Tris-HCl 和蛋白质水解产生的盐），且上样前需确保溶液的 pH<3。若盐浓度高于 20_〇 1/L，可用膜透析（见步骤③和④），或依制造商提供的指导用 Ql8 固相抽提（SPE) 柱（Vydac) 除盐。二、SCX 色谱柱的准备 9.以 SCX 缓冲液和 SCX 色谱柱为基础建立 HPLC 系统。 10.设置柱流速为 200ul/min，获得空白梯度。用于多肽洗脱的缓冲液 B 在约 5%~35% 的区间应采取平缓梯度（见表 8.12)，这样可使净电荷为+2 的多肽片段（为胰酶酶解的主要产物）比线性梯度洗脱有更好的分离效果。 11.检测 SCX 柱的性能（1）将溶于缓冲液 A 中的 200pmol 多肽标准品加至 SCX 柱上。（2）用 UV 检测仪检测多肽在 214nm 的吸收。应能获得 6 个完全分离的且峰宽小于 1min 的洗脱峰。三、SCX 色谱分离酵母肽混合物 12.将酸化的（pH<3) 的酵母酶解多肽样品加到柱上，用缓冲液 A 洗柱 5~10min，直至 UV 检测峰返回基线。 13.开始梯度洗脱，每分钟收集 200ul 洗脱组分。图 8.44 所示为利用该技术分离 Img 酵母蛋白的洗脱图谱。该技术可以分离多达 5 mg 的多肽，可根据样品量选用更大或更小的柱子。 14通过离心蒸发浓缩样品体积至 50~100ul。四、SCX 色谱分离组分的 RPC 层析将纳升级的反相色谱毛细管 LC 串联离子阱质谱仪，进行在线检测，其灵敏度最大，可鉴定的多肽最多。串联后，多肽的检测水平可达 1~5 fmol，并且串联质谱的获取速度达 2000 个图谱/h。 15.将一支内径 75 um、长 20 cm 的桂化毛细管拉成针尖。有很多方法可用于拉制电喷雾的细针。最简单的方法是将一重物（用胶带纸）粘在针上，然后用微火焰将毛细管拉尖。另外，在方案 5 中介绍的激光拉针器也很有效。不过，拉好的针或预装柱也可以买到（例如，NewObjective，Cambridge，Massachusetts)。 16.取一根已拉尖的 75 um 的硅化毛细管，其中填充 5um、200A 的 C18 颗粒，柱床长度 12 cm(填充毛细管的方法详见方案 4 或方案 5)。毛细管的针尖不仅可以填料，而且还可充当 MS 的电喷雾针。 17.按照下列步骤连接微型四通的 4 个臂： (1)来自 HPLC 的流动相（lOOjul/min); (2)用于分流（50ym 内径 X50 cm) 的限流毛细管；流速 99.7ul/min; (3)一根连接到高压电源（1.8kV) 的金导线； (4)拉尖的纳升级反相毛细管柱（步骤?），流速为 300nl/min。 18.将 HPLC 的流速调至 100u1/min，利用微型四通进行分流，使流向反相层析柱的流速为 300nl/min。 19.取经 SCX 色谱分离的组分 50ul, 离线加压上样（pressure-loadoff-line)，每次加样 10 ul 或更多，然后进行梯度洗脱。 20.向 ESI 提交洗脱峰并在离子阱质谱中分析。 MS 以两种模式运行，即 MS 模式（测定多肽离子的 m/z) 和 MS/MS 模式（多肽测序）。在短短的 1 h 的反相 LC-MS/MS 分析中，数据依赖型的 MS/MS 扫描可进行上千次肽段测序，将从 MS 扫描中所选择测序的多肽设定为「on the fly」，从每个 MS 图谱中选择 5 个肽段进行测序（裂解）。展开