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二维LC×LC耦合技术解析

2020.3.06

近年来，关于二维液相色谱的研究和讨论日趋白热化。对于实验室的常规分析和研究工作来说，这种新技术的优势何在？在哪些地方仍有开发的需求？本文将对此予以详细解读。

生命科学各领域中分析的样品日趋复杂化，相应地也促进了环境分析的技术发展。科研人员于十几年前首次应用多组分分析方法检测目标分析物，而今则能在一次流程中分析上百种组分及其代谢产物和过渡形态的产物。选定质谱仪为检测器，分析方法可采用串联质谱法，针对目标溶质进行选择性检测和定量；也可应用液相色谱法，阐明饮用水处理过程中复杂的降解机理。此处需应用具有高数据采集速率且能准确测定化学式的质量检测器，飞行时间质谱仪能满足上述检测需求。此外，应用四级杆与飞行时间质谱Q-TOF技术，还可进行结构表征的碎片化实验。

应用高效能质谱检测器时，样品的基体和共洗脱物质常常成为令实验人员感到棘手的问题，尤其是分析带有不同基体的农药残留时，会出现明显的信号重叠。这种离子抑制效应会对定量方法造成影响，对潜在的未知代谢物和过度产物的检测亦是如此。高浓度的组分信号，可能将低浓度的组分信号完全掩盖。

二维液相色谱

在此背景下，出现了真正提高峰容量及改进分离色谱技术的技术复兴。其中之一就是UHPLC（超高压高效液相色谱），其柱子填充料粒度小（＜2μm）因而产生高达1000bar的柱压；另一途径则是通过模块阀将两个色谱系统耦合，将第一维分离柱的洗脱物按照确定的时间间隔导向样品环予以收集，然后导入第二根柱子，相应的二维LC×LC耦合结构示意图如图1所示。来自第一维柱子的洗脱物被连续地导入模块阀，模块阀中设有两个样品环，达到确定的收集时间后，模块即被转动，使收集的洗脱物注入第二根柱子中，而从第一维柱子流出的洗脱物则被第二个样品环收集。这一过程循环往复，直至所有组分从第一根柱子中洗脱为止。

二维LC×LC耦合的优点在于：基于两种分离系统不同的选择性，能够在第二根柱子上分离共洗脱物质。除了能够提供峰容量外，还减少了应用质谱仪时出现抑制效应的风险。

耦合技术的挑战，在于如何在二维分离中实现极快的梯度分离。在样品环中短暂的收集时间决定了在第二维中的流动时间，在LC×LC耦合范围所提供的解决方案中，出现的问题往往是在第二维中大于2ml/min的过高流速，受到电喷雾离子化的适配性限制。针对这种情况采取的解决方案为：以纳升级高效液相色谱（nano HPLC）为第一维，毛细管高效液相色谱作为第二维的分离系统，通过采用核壳结构材料及提高柱温的方法，提高在第二维中的线性流速而不提高总流速。实际上，温度的提高还降低了流动相的粘度以及由此产生的反压力。

LC×LC-TOF-MS系统

图2为LC×LC-TOF-MS系统的结构图。将二维液相系统和TOF-MS系统加以耦合。该二维液相系统的优点在于：两个10位阀和泵出口端的紧密安排，借两根分离柱能以最短的方式相互连接。为了减小由毛细管过长和内径过大所引起的峰变宽效应，通过一个金属连接件以鳄鱼夹将电喷雾离子化源接地，并采用了专为低流速而设置的发射尖端。

图3是水池尘埃试样的全离子流色谱图。除了进一步开发分析技术之外，德国能源和环境技术研究所（IUTA）还从事与室内卫生相关的课题研究。室内尘埃不仅本身是复杂的基体，还是一种较难挥发物质的收集剂。从居住空间内富集这种物质，可作为指示剂，判断其中的毒性物质能否对居民健康造成危害。

由于当对所有单个质点微粒进行反卷积之后，才能显示出所有的物质峰，因此对图3显示的全离子流色谱图的解释是十分复杂的。鉴于本文所述的耦合技术而言，原制造商并未能够提供相应的软件解决方案来自动地利用二维的质谱数据，因此只能启用IUTA建立的软件Makros。不过凭借所得的全离子流色谱图仍能对保留机理做出初步的说明。在一维分离中，应用由纯多孔石墨化材料（Hypercarb）装填的柱。该填装柱的优点是：即便是极性组分也有明确的保留时间。在二维分离中，应用了反相的多孔颗粒材料，借以获得较高的线性流速。值得注意的是：在基于两种静止相的不同分离机理之上所作出的等值线图中却出现了一种反对角线式的图形。分离伊始，极性组分在二维中几乎没有保留地进行，而35min后这种机理调换了方向。在Hypercarb相中仅有中度延迟的组分，却突然在反相柱上表现出明显的保留。在进一步的色谱分离过程中，在反相柱上的保留又会降低，而在Hypercarb相中的保留则重新增加。“极化-保留效应”可对这种情况加以解释。

小结

未来在二维LC×LC耦合领域中的研究重点，是系统地评估针对毛细管和纳米柱进行的大体积进样注射。这项工作通过模拟Bischof提出的POP-LC（相优化液相色谱）理念，已在传统LC-MS耦合系统所用的柱子联合中得到有效的验证。

二维液相色谱

通过模块阀在二维液相色谱中将两种色谱分离系统耦合，让第一维的洗脱物在确定的时间间隔内进入样品环中收集，再导入第二维分离柱中。二维LC×LC耦合技术的优点在于：利用两种分离系统不同的选择性，可在第二根柱子上分离共洗脱物质。不仅能提高峰容量，还减小了抑制效应。

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