糖皮质激素的SPE-LC/MS测定
本文建立了固相萃取-液质联用对化妆品中泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松、倍他米松、地塞米松等11种糖皮质激素同时检测的方法。
糖皮质激素是临床常用的一类药物，对皮肤病有良好的消炎作用，可抑制纤维细胞增生，减少5-羟色胺的形成，因此短时间内对皮肤有一定的嫩白作用。然而长期使用，会造成皮肤变薄、毛细血管扩张、毛囊萎缩等现象，一旦停用，皮肤就会发红、发痒，出现红斑、皮疹等，因此我国《化妆品卫生规范》明确规定此类物质为禁用成分。目前糖皮质激素的检测多集中在药品中有效成分和尿液中糖皮质激素的检测，化妆品中糖皮质激素的检测文献报道较少。本文采用Clearnert PEP-2 SPE净化的方法，建立了同时检测化妆品中泼尼松、泼尼松龙、可的松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、醋酸可的松、醋酸泼尼松、醋酸氢化可的松、曲安奈德11种糖皮质激素的方法。
表1. 糖皮质激素类药物标准品信息
实验方法
实验试剂和材料
糖皮质激素类药物标准品信息见表1，实验试剂见表2，仪器和设备见表3。
表2. 实验试剂
糖皮质激素类药物标准溶液配制
标准贮备液 分别精密称取适量的12种糖皮质激素标准品，用甲醇溶解定容，分别配制成1000μg/ml的贮备液，-20℃以下保存。
表3. 实验用仪器和设备
混合标准工作液 准确量取糖皮质激素类药物标准贮备液适量，用20%乙腈水溶液稀释成适宜浓度的混合标准工作液，现配现用。
表4. 流动相梯度洗脱条件和流速
实验试剂的配置
10%亚铁氰化钾溶液：称量2.3g K4Fe（CN）6.3H2O，用水溶解定容至20ml；
20%乙酸锌溶液：称量4.78g C4H6O4Zn.2H2O，用水溶解定容至20ml；
定容液：量取70ml水和30ml乙腈，混匀后加入100μl甲酸混匀。
表5. 糖皮质激素类药物多反应监测的优化参数
测定步骤
提取 霜膏类化妆品的提取：称取0.2g试样（精确至0.01g）于50ml离心管，混匀。加入3 ml饱和氯化钠溶液，涡旋混合使样品分散，加入2ml乙腈，超声提取5min，8000r/min离心5min，吸取上层清液于另一50ml离心管中，下层氯化钠溶液用2ml乙腈重复提取1次，合并2次乙腈提取液，往提取液加入40ml去离子水，混匀，加入亚铁氰化钾溶液0.2ml，混匀，加入乙酸锌溶液0.2ml，混匀，8000r/min离心10min，作为待进化液。
精油类样品的提取：称取0.5g试样（精确至0.01g）于50ml离心管，混匀。加入4ml正己烷，涡旋混合使样品分散，加入4ml 50%乙腈水溶液，涡旋提取2min，8000r/min离心5min，吸取下层提取液，上层正己烷用4ml 50%乙腈水溶液重复上述提取步骤一次，合并2次50%乙腈提取液，往提取液加入36ml去离子水，混合，加入亚铁氰化钾溶液0.1ml，混匀，加入乙酸锌溶液0.1ml，混匀，8000r/min离心10min，作为待进化液。
表6. 11种糖皮质激素线性回归方程和检出限
净化 将PEP-2固相萃取小柱接上固相萃取装置，小柱上端紧密连接一个60ml装有筛板的上样管，小柱预先用5ml甲醇、10ml水活化。将上述待净化液全部上样，待样品溶液自然流尽后，再用10ml乙腈水溶液（10%）淋洗小柱，待清洗液自然流尽后，取下上样管，用吸球吹出小柱中的残留液。用6ml甲醇洗脱小柱，待甲醇自然流尽后，用吸球吹出小柱中的残留液，收集洗脱液于40℃氮气吹干，用1ml定容液溶解定容，过0.22μm尼龙滤膜，待测。
测定 液相色谱条件：色谱柱ASB C18，3μm，150Å，2.1mm×150mm；流动相A相：含0.1%甲酸的水溶液；流动相B相：含0.1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序见表4；柱温：30℃；进样量：10μl。
质谱条件：质谱仪为API 4000+；离子源为电喷雾离子源；扫描方式为负离子扫描；检测方式为多反应监测；IS为-4500V；GS1为55Psi；GS2为55Psi；TEM为550℃；
糖皮质激素类药物多反应监测的优化参数见表5。
表7. 玫瑰精油0.1μg/g添加回收实验结果
结果与讨论
净化条件的选择
目前文献报道的净化方法多选用聚合物基质的吸附性材料或硅胶基质的ODS SPE小柱。本文选用Cleanert PEP-2 SPE小柱，实验结果表明其可同时对11种糖皮质激素有很好的吸附。
考察了不同体积分数0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%乙腈的水溶液的洗脱效果，结果表明使用10%乙腈的水溶液，可保证11种糖皮质激素不被洗脱下来，所以最终选用10%乙腈的水溶液做淋洗液，并且在上样之前要用水将乙腈的提取液稀释。
液相色谱柱的选择
在本文要同时检测的11种糖皮质激素中，可的松和氢化可的松、倍他米松和地塞米松为同分异构体，在反相液相色谱中比较难分离。通过比较不同C18的分离效果，最终选用Venusil ASB C18（3μm，150Å，2.1mm×150mm）为色谱柱，可保证11种糖皮质激素在15min内均达到基线分离。
表8. 玫瑰精油0.05μg/g添加回收实验结果
线性关系和检出限
将浓度分别为2、5、10、20和50μg/L的混合标准溶液依次进样分析，以峰面积Y对浓度X（μg/L）拟合回归方程，结果见表6。结果表明，11种糖皮质激素分别在2~50μg/L范围内呈线性，相关系数r大于0.999。
准确度和重现性
以市售玫瑰精油和护手霜为基质，进行添加回收实验，进行0.1μg/g和0.05μg/g添加浓度的实验，11种糖皮质激素的回收率均在75%~120%之间，具体实验结果请见表7~9。
表9. 护手霜0.1μg/g添加回收实验结果
小结
使用Cleanert PEP-2、Venusil ASB C18建立了一种化妆品中11种糖皮质激素同时检测的分析方法，实验结果表明本方法快速、准确，可用于化妆品中糖皮质激素的检测。
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