醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质实验方法（二）

2020.6.03

6、染色

通电完毕，立即取出薄膜直接浸入丽春红S或氨基黑10B染色液中，染色5～10分钟。

7、漂洗

至少准备3～4个漂洗皿，装入漂洗液。从染色液中取出薄膜条并尽量沥去染色液，按顺序投入漂洗液中反复漂洗，直至背景漂白为止。此时清晰可见5条色带。待干。

8、定量

（1）洗脱比色法取六支试管，分别标明“A、α1、α2、β、γ、空白”。将漂洗净的薄膜剪下各区带放入相应的试管内，另从空白背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中，根据染色不同按以下方法洗脱。

①氨基黑10B染色洗脱：6支试管于清蛋白管内加入0.4mmol/L NaOH溶液6ml,其余5管各加3ml，振摇数次，置37℃水浴20分钟，使色泽完全浸出。用620nm波长，以空白管调零，读取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。

②丽春红S染色洗脱：洗脱液用0.1mmol/L氢氧化钠溶液，加入量同上。10分钟后，于清蛋白管内加入40％（V／V）醋酸0.6ml，其余5管各加入0.3ml，以中和部分氢氧化钠，使溶液色泽加深。如出现沉淀，可离心取上清液比色。用520nm波长，以空白管调零，读取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。

（2）光密度扫描法

① 透明：将已漂净吹干的CAM条浸入透明液中3～5分钟，取出平铺于洁净干燥玻片上（应无气泡），直立片刻除去过多的透明液。于90～100℃烘箱内烘烤5～10分钟，取出冷却至室温。此法透明的CAM，各蛋白区带鲜明，薄膜平整，可直接扫描或作永久保存。若用十萘氢或液体石醋透明，应将漂洗过的薄膜烘干后进行透明，透吸后的薄膜不能久藏，易发生皱折。

② 扫描定量：将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其它光密度扫描的光路，选择波长520nm，描记各蛋白区带峰，并计算各蛋白成分的相对含量。

9、计算

定量计算时，先计算各光密度值的总和：再计算血清各部分蛋白质所占的百分率

                                            吸光度总和（T）＝2A＋α1＋α2＋β＋γ（吸光度）

                                            血清各蛋白组分的相对百分数＝Ax/AT×100％

                                         Ax表示各球蛋白组分（2A＋α1＋α2＋β＋γ）的吸光度。

                                             A％＝2A/ T×100％       β＝β/ T×100％

                            α1％＝α1/ T×100％        γ％＝γ/ T×100％       α2％＝α2/ T×100％

                             各组分蛋白质含量（g/L）＝(各组分蛋白百分数(%)×血清总蛋白g/L)/100

10、临床意义

（1）血清蛋白醋纤薄膜电泳的正常参考值为：

         蛋白质组分                g/L             占总蛋白百分比(%)
　　     白蛋白                  35～52               57.0～68.0
        α1球蛋白              1.0～4.0             1.0～5.7
       α2球蛋白              4.0～8.0              4.9～11.2
        β球蛋白               5.0～10.0             7.0～13.0
        γ球蛋白               6.0～13.0             9.8～18.2

（2）临床意义

电泳图谱可为临床疾病诊断提供依据。

肾病型可见于急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭等，图型表现为Alb降低，α2和β升高；肝硬化型可见于慢性活动性肝炎、肝硬变等，图型表现为Alb降低，β和γ增高，可出现β与γ难以分离而连接在一起的“β－γ”桥，此现象是由于肝脏纤维增生导致IgA增高所致；急性反应时相型常以α1、α2增高为特征；慢性炎症型则以Alb降低，α2、γ增高较为常见；M蛋白血症主要见于多发性骨髓瘤，病人有大量单克隆蛋白质（主要是IgG或IgA），电泳时可在β和βγ之间出现一条峰形狭窄的区带，称M区带。

注意事项

1．通电时，不得接触槽内的缓冲液或CAM，以防触电。

2．每次电泳时应交换电极以使两侧电泳槽内缓冲液的正负离子相互交换，以使缓冲液的PH维持在一定水平。

3．电泳缓冲液的液面要保持一定的高度，过低可能会出现γ球蛋白的电渗现象（γ球蛋白向阴极移动），同时电泳槽两侧的液面应保持在同一水平，否则，通过薄膜时有虹吸现象，将会影响蛋白质分子的泳动速度。

4．电泳失败或图谱不理想的常见原因

（1）电泳图谱不整齐或蛋白各组分分不佳：点样过多；点样不均匀、不整齐；薄膜过湿，样品扩散；点样速度太慢，薄膜表面局部干燥或薄膜未完全浸透或温度过高致使膜面局部干燥或水分蒸发；缓冲液变质；电泳时薄膜放置不正，歪斜、弯曲，与电流方向不平行；样品不新鲜；电流过低；CAM质量不好，薄膜结构过分细密，透水性差，导电差等。

（2）染色后白蛋白中间着色浅：染色时间不够或染色液陈旧；白蛋白含量过高，可减少血清用量或延长染色时间。

（3）电泳速度慢：电流过低；供给薄膜的缓冲液不足，连接薄膜与缓冲液的滤纸或纱布过薄；温度过低；薄膜结构过分细密，透水性差，导电差；缓冲液水分蒸发，致使离子强度增大。

（4）薄膜透明不完全：透明液陈旧；浸泡时间不足；烘箱温度未到90℃即把薄膜放入。

5．染料问题：各种染料对血清各组分有不同的亲和力，大多数染料对白蛋白的亲和力大于球蛋白。如氨基黑10B对球蛋白的结合力为白蛋白的80％，因此常导致白蛋白结果偏高，球蛋白偏低。用丽春红S染色，效果优于氨基黑10B。丽红是一种指示剂，PH＜10时呈红色，PH＞12.5时呈紫色。在酸性溶液中它的最大吸收峰在523nm左右，呈对称性。在血清蛋白正常浓度范围内，丽春红S能与各蛋白质组分成正比例结合，而氨基黑10B则对白蛋白染色过深，区带中容易出现着色不全的小点，不够理想。

6．样品要求点在粗糙面（无光泽面），否则样品很难吸入膜内。电泳时最好将点有样品的一面朝下，以防电泳过程中水分蒸发，影响电泳结果。

7．标本应新鲜，不得溶血。溶血标本会使β球蛋白假性升高，因血红蛋白电泳位置在β球蛋白区域内。

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周锦帆