应用流式细胞仪检测CD34+细胞方法学评价
应用流式细胞术(FACS)测定动员后的外周血及采集的自体外周血造血干细胞(APBSC)中的CD34+细胞及其亚群,操作简单、快速、重复性好,对及时掌握最佳采集时机,准确判断采集的干/祖细胞数量具有重要指导意义。为准确检测外周血及APBSC中的CD34+细胞,本文比较了几种FACS检测CD34+细胞方法的异同。
1、材料与方法
1.1 外周血造血干细胞 APBSC采集自经环磷酰胺(CTX)+重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员后的实体瘤患者(淋巴瘤、乳腺癌),采集使用CS3000- Plus血细胞分离机(Baxter公司,美国)。
1.2 CD34+细胞的标记 对10份APBSC分别进行2种不同再处理与CD34标记。
1.2.1 溶血法 APBSC与CD34-PE荧光单克隆抗体(Immunotec,法国)室温暗处反应15min,然后用细胞裂解液溶解红细胞,待测。
1.2.2 分离单个核细胞法 经Ficoll(相对密度1.007)梯度离心,收集界面层单个核细胞,与CD34-PE标记的单抗室温孵育15 min,待测。
1.3 FACS检测CD34+细胞 上述标记细胞悬液分为2管,其中一管6 h内使用流式细胞仪(EPICS ELITE ESP, COULTER公司)测定CD34+细胞占单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)的百分率,另一管经1%多聚甲醛固定,4℃冰箱保存72 h后,FACS测定CD34+细胞数。
1.4 荧光标记的CD34单克隆抗体 33份APBSC同时分别用表达第2类抗原表位QBEnd 10(ClassⅡ,Immunotec)和表达第3类抗原表位8G12(HPCA2,classⅢ,Becton Dickinson)的单抗进行标记,比较2组CD34+细胞百分率之间的差异。
1.5 双标记CD34/CD45 APBSC中同时加入抗CD45-FITC(J33)和抗CD34-PE(HPCA2),用溶血法处理细胞,FACS测定CD34+细胞。
1.6 统计学处理 用t检验。
2、结果
2.1 溶血法与单个核细胞标记法测得CD34+ 细胞百分率无显著性差异(P>0.50)。
2.2 同一样品经1%多聚甲醛固定72 h后的测定值与6 h内的测定值相比,CD34+ 细胞荧光强度降低,非特异吸附增加,变异系数范围在 9.9%~49.5%之间,平均CV值为32.2%。
2.3 APBSC标本分别用2种CD34单体标记,CD34+细胞百分率无显著性差异(P>0.05)。
2.4 CD34-PE/CD45-FITC双标记测定APBSC中CD34+细胞的百分率为4.5%,而同一组样品进行CD34+细胞单色标记为5.3%。
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