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运用ACQUITY Arc可靠地对肽图分析方法进行转换（四）

2020.5.25

图3A展示了使用3.5 μm色谱柱在Agilent 1100系列HPLC系统上获得的色谱图，以便进行比较(另见：图1A)。图3B展示了使用2.5 μm色谱柱在ACQUITY Arc系统上获得的结果，图3C展示了相应的质谱响应。将色谱柱粒径由3.5 μm降至2.5 μm，可以观察到微小的分离度差异。UV/Vis数据与相应的质谱数据高度相关，表明ACQUITY QDa质谱检测器可应用于常规分析。

ACQUITY QDa质谱检测器的引入，能够在完成色谱峰表征之后为分析人员提供确证鉴定结果所需的质谱数据，帮助他们进行批释放测试和产品批次间的比较分析。以肽序列ASQFVGSSIHWYQQR为例，粗体部分表示互补决定区(CDR)序列。根据肽的平均质量1794.0 Da，我们可计算出相应电荷态离子[M+1H]+1、[M+2H]+2和[M+3H]+3的质量分别为1795.0 Da、898.0Da和599.0 Da。图4A中光学积分峰的质谱数据与图4B中峰顶点的质谱数据相当。我们为ACQUITY QDa质谱检测器设定的扫描范围为350 m/z到最大值1250 m/z。从图4B的质谱数据中我们可以观察到不同电荷态都可以落在该扫描范围内。在实验室环境中完成表征之后，进一步获取质谱数据有助于分析人员对产品进行确认。

英夫利昔单抗的肽图对比，分别采用A) Agilent 1100系列HPLC系统和B) ACQUITY Arc系统采集数据，图C)则为通过ACQUITY QDa质谱检测器获得的相应质谱数据。Agilent 1100系列HPLC系统采集数据数据时使用的是填充3.5 μm颗粒的XBridge BEH C18 130 Å, 4.6 mm x 100 mm色谱柱，而ACQUITY Arc 系统采集数据时使用的是填充2.5 μm颗粒的XBridge BEH C18 130 Å, 4.6 mm x 100 mm色谱柱。相应的质谱数据与光学数据高度相关。

图3. 英夫利昔单抗的肽图对比，分别采用A) Agilent 1100系列HPLC系统和B) ACQUITY Arc系统采集数据，图C)则为通过ACQUITY QDa质谱检测器获得的相应质谱数据。Agilent 1100系列HPLC系统采集数据数据时使用的是填充3.5 μm颗粒的XBridge BEH C18 130 Å, 4.6 mm x 100 mm色谱柱，而ACQUITY Arc 系统采集数据时使用的是填充2.5 μm颗粒的XBridge BEH C18 130 Å, 4.6 mm x 100 mm色谱柱。相应的质谱数据与光学数据高度相关。

来自ACQUITY Arc系统的英夫利昔单抗肽图的放大图，分别展示了A)光学数据以及B)光谱积分峰的相应质谱数据。采集数据时使用的是填充2.5 μm颗粒的XBridge BEH C18130 Å, 4.6 mm x 100 mm色谱柱。图B)中所示的电荷态分别对应为肽序列ASQFVGSSIHWYQQR(粗体部分代表CDR序列)的[M+1H]+1和[M+2H]+2计算所得的值。

图4. 来自ACQUITY Arc系统的英夫利昔单抗肽图的放大图，分别展示了A)光学数据以及B)光谱积分峰的相应质谱数据。采集数据时使用的是填充2.5 μm颗粒的XBridge BEH C18130 Å, 4.6 mm x 100 mm色谱柱。图B)中所示的电荷态分别对应为肽序列ASQFVGSSIHWYQQR(粗体部分代表CDR序列)的[M+1H]+1和[M+2H]+2计算所得的值。

结论

生物制药行业已经认识到了应用新技术和新方法的重要性，纷纷向实验室中引入ACQUITY Arc系统等现代化的LC平台。随着分析方法越来越频繁地在整个机构中进行转换或转换到合同研究机构中，我们需要证明分析方法在相同及不同的类似仪器平台上能够获得一致的结果。ACQUITY Arc系统不仅可以模拟传统的HPLC方法，还能应用Arc Multi-flow path技术将HPLC方法升级为UHPLC方法。通过将HPLC方法升级为UHPLC方法并结合ACQUITY QDa质谱检测器，我们可以将常规的质谱检测结合到分析中，以利于结果的确认。

参考文献

1. Koshel, B. M., McCarthy, S. M. Transfer of an SEC Method for Monoclonal Antibody Analysis from HPLC to UHPLC using the ACQUITY Arc System. 2015; 720005510en.

2. Koshel, B. M., McCarthy, S. M. IEX Method Transfer: Replicating a Method for Monoclonal Antibody Analysis on an ACQUITY Arc System. 2015; 720005529en.

3. Luo, Y. et al. Handbook of Modern Pharmaceutical Analysis.In Separation Science and Technology; Ahuja, S.;Scypinski, S., Ed.; Academic Press: Burlington, MA, 2010;Vol. 10; pp 283–359.

4. U.S. Pharmacopeial Convention, General Chapter <1055>Biotechnology-Derived Articles- Peptide Mapping,USP38-NF33, Official from August 1, 2015.

5. Hong, P., McConville, P. R. Method Transfer from Agilent 1100 Series LC System to the ACQUITY UPLC H-Class System: The Effect of Temperature. 2015; 720005204en.

6. ACQUITY Arc System Brochure. Waters Brochure. 2015;720005393en.

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周锦帆