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细胞系错误鉴定：终结的开始（三）

2020.5.25

交叉污染检测

许多方法已被用来检测交叉污染，包括同工酶分析、核型分析、人类白细胞抗原（HLA）分型，免疫分型和DNA指纹识别。这些方法都可以鉴别出某一种细胞系，但是分辨能力各不一样。然而，这些方法在不同实验室所得到的数据却不尽相同，以致没有任何一种方法可以用来建立一个标准参考数据库。

许多实验室利用STR分型来鉴定人源细胞系。STR分型是一种用来做亲缘分析的方法，它的原理是在一单管中同时扩增多个多态性DNA片段。STR位点是由不同数目重复单元组成的重复DNA序列。每一个STR位点均能被扩增且扩增产物标记上不同颜色的荧光，使得扩增产物很容易通过片段大小和颜色来区分。STR分型快速、经济、易于自动化，能得到可重复的数据，且数据格式适合建立一个标准参考数据库。由于快速、鉴定的细胞系结果明确，STR分型的应用价值最大。

STR分型——潜力及局限

3-5个碱基重复的DNA重复序列已常规性地用来做亲缘鉴定、法医鉴定、以及鉴定在20年之前的大灾难中遇难的受害者。随后，STR分型用于细胞鉴定中。用STR分型来做细胞鉴定有几大优势。

肿瘤细胞系包含许多遗传改变，因此用STR分型来分析肿瘤细胞系的标准必须与正常组织不一（见补充信息Box3）。肿瘤细胞通常会表现出杂合性丢失（即缺失一个等位基因以致难以与纯合子相区分），另外由于DNA复制，肿瘤细胞可携带等位基因的多个拷贝。与此类似，在肿瘤细胞培养过程中，肿瘤细胞系既可失去等位基因的一个拷贝，也可偶尔获得一个拷贝。所以，相同细胞系的亚系可能会含有不同的STR分型。

对比相同的等位基因，已往发表的数据表明，75%的一致性已能鉴别出所有已知的交叉污染细胞系，一致性超过50%的两个细胞系不会认为是来源于不同个体，因此，在单一细胞系和存在交叉污染的细胞系之间存在25%的“缓冲区”，任何细胞系只要一致性水平在50%和75%之间，它就应该认为是可疑的。

在分析人类细胞系基因型中，其主要的问题包括杂合子峰高不平衡（即一等位基因的峰高或面积远大于另一等位基因）、某一基因座出现多个等位基因、等位基因丢失（目的片段未能扩增）。由于肿瘤细胞系为非整倍体，所以其杂合子峰高不平衡以及在一个或多个基因座出现多个等位基因的现象非常典型。

基因分型所需费用是大家主要关心的问题，但是相对于细胞系的整个工作来讲其费用就微不足道了。STR分型的费用包括DNA提取、STR 位点的PCR扩增、毛细管电泳分离扩增片段和数据分析。增加STR基因座的数目如从6个到15个将会达到一个非常高的分辨率。

STR分型存在一个大的局限，就是它不能检测来源于其他物种的污染细胞，哪怕是人类细胞被过生长的其它物种细胞所覆盖，用人类或高等灵长类特异性引物也不会有DNA扩增。在PCR中采用用物种特异性引物可以用来检测来源于其它物种的污染细胞。如果应用于其它物种的STR分型已被建立（目前局限于少数几个具有重要商业价值的物种），STR分型无疑可被用来鉴定污染细胞。

对于大部分已被建立的细胞系，供体组织已不能获得，那些被广泛使用的细胞系其最初来源者要么退休要么已辞世。在这些情况下，一种基于储存于细胞库中可能是最老的细胞群假想出现了。这些分型将需要标记上“临时”来指示缺乏对最初供体组织的分型鉴定。

在下面描述的数据库可用之前，能用来对比STR分型的可用资源极为有限。ATCC和DSMZ细胞库网站，以及CLIMA（细胞系分子鉴定整合数据库）提供了一些信息，至少两种系列的STR分型数据已公布。目前，最有用的资源之一是Amanda Capes-Davis 和Ian Freshney收集的错误鉴定细胞系清单，这在欧洲细胞培养物收藏所（ECACC）网站上也可查看。所有的科研工作者都应对照这一清单来核对他们正在使用的细胞系名称。

交互式数据库

有人提议建立一个旨在开发可用STR分型数据的数据库，这些数据可作为人类细胞系鉴定的数据。交互式数据库任何人都可进入，但只有数据库管理员才能对数据进行修改或补充。这个数据库不仅提供DNA分型，还能允许实验室将他们的细胞系STR分型数据与数据库里的细胞系数据相比较，这样便于确保实验数据的可靠性。

通用标准是组成一个好的数据库的必备条件，应用细胞鉴定的标准可以建立起一个由每一个有确定STR分型的单一细胞系组成的交互式数据库，并为STR分型检测以及分析提供必备条件。标准制定委员会的成员将会与NCBI协作开发交互式数据库所需要的条件，数据库由NCBI维护。数据库最初只包含科研人员常用的并保存在大型细胞库的500个已证实的细胞系。

每一个细胞系在被提交至数据库之前都会确定其STR分型。比对STR分型数据最有效的数据库会由一组常见的标记物组成。然而，并不是所有的数据都是收集相同的STR位点或是用同一代的测序仪器得到的。针对相同的STR标记使用不用引物组合是法医和人身份鉴定中的惯例，美国的联邦调查局联合DNA索引系统（CODIS）就是采用13个核心STR位点组合来录入数据的。为了能维持进入CODIS的数据之间的整合，各实验室必须使用CODIS认可的STR分型试剂盒和仪器，并且严格按照质量保证标准来操作。CODIS认可的试剂盒已经历了大量的验证研究，包括旨在解释使用不同引物组合时出现STR分型差别的一致性研究。相同的程序会是细胞STR分型所必需的。

未来

从增加的数据可信性、只需很少的时间和费用，以及研究被错误鉴定的细胞系的所花费的精力来看，细胞系STR分型鉴定将会在科学研究中产生重大影响。细胞系的精确鉴定在研发基于细胞下的医学产品起到至关重要的作用，它能避免将人体细胞暴露于错误鉴定细胞中的风险。尽管这种错误鉴定大部分可以通过遵循质控措施而避免，例如正确标记、在生产基于细胞的医学产品时采取跟踪计划，但是当用来证实一个来源于预期供体的细胞产品以及它被有意地与其它供体细胞混合时，利用可明确鉴定细胞和组织的标准方法将会提供安全保障。这个问题对于个体化医疗和应用基于干细胞的技术（包括诱导多能干细胞）非常重要。

没有一个单一的方法可提供所有的信息来鉴定一个人类细胞系。STR分型是这一时期的最佳代表，因此，随着新信息的可用，STR分型标准将会不断地改进。向任何人开放的交互式、可搜寻的数据库将会大大减低错误鉴定细胞的使用率。基金部门和期刊也被鼓励采取对使用错误鉴定细胞“零容忍”的政策并要求作者提供证据以支持其使用的为正确的细胞系。

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周锦帆