Cancer Cell丨单细胞转录组揭示浆细胞可作为非小细胞肺癌PD-L1免疫疗法的预后标志物

中科新生命蛋白代谢多组学

2022.6.09

肺癌是致死率最高的癌症类型，其中80%至85%的肺癌属于非小细胞肺癌（NSCLC）亚型。PD-L1治疗可以显著提高NSCLC患者生存率，然而绝大部分NSCLC患者对PD-L1的单一药物治疗没有反应。在以往的研究中，都是以T细胞作为预测PD-L1免疫疗法的预后标志物，而Genentech公司的Romain Banchereau和David S. Shames领衔的研究团队利用单细胞转录组结合bulk RNA-seq联合分析，发现肿瘤内浆细胞可以作为非小细胞肺癌中PD-L1抑制剂（阿替唑单抗）治疗预后的预测标志物。其研究成果：“Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer”发表于Cancer Cell期刊。

研究材料

192名随机II期临床试验（POPLAR）中接受阿替唑单抗治疗（n=96）或多西紫杉醇化疗（n=96）患者的非小细胞肺癌（NSCLC）FFPE组织；

699名随机III期临床试验（OAK）中接受阿替唑单抗治疗(n=350)或多西紫杉醇化疗(n=349)患者的非小细胞肺癌（NSCLC）FFPE组织；

三个独立的NSCLC患者单细胞转录组数据集；

29例人非小细胞肺癌（NSCLC）组织：转移性淋巴结（mLN）、非转移性淋巴结（nLN）、正常癌旁组织（nLung）、肿瘤活检（Tbio）和肿瘤切除（T res）。

技术路线

步骤1：Bulk-RNA数据分析与阿替唑单抗治疗的患者总体生存（OS）改善显著相关的B细胞特征；

步骤2：通过对NSCLC样本进行单细胞转录组测序（scRNA-seq），识别肿瘤内不同B细胞的转录组特征，并验证了分析结果；

步骤3：scRNA-seq联合bulk-RNAseq分析目标B细胞特征；

步骤4：确定高浆细胞特征与阿替唑单抗治疗后的患者生存率的关系；

步骤5：确定浆细胞特征在具有三级淋巴结构(TLS)和/或淋巴聚集（LAs）的肿瘤中富集。

研究结果

1. 阿替唑单抗治疗患者的B细胞转录特征与患者生存率改善相关

为了探究阿替唑单抗治疗患者的内在特征与患者生存率的关系，研究者对OAK随机III期临床试验中接受阿替唑单抗治疗后受益患者和无受益患者进行常规转录组测序分析。结果发现，受益患者中与B细胞（浆细胞）相关的基因高表达，如CD79A、CD19等（图1 A），然而在化疗组中这些基因表达均不显著（图1 B），表明这些基因对阿替唑单抗治疗的效果具有预测价值。为了验证这一价值，研究者在OAK随机III期临床试验中进行了生存分析，发现B细胞标记物CD79A和CD19的高表达与IFNG或IFN诱导的趋化因子CXCL10相比，更显著的改善了患者总体生存率（图1 C-F）。

图1 肿瘤内B细胞与患者总体生存（OS）相关

2. 单细胞转录组数据确定B细胞亚群表达特征

为了进一步研究与阿替唑单抗治疗相关的B细胞表达特征，研究者对44例NSCLC患者的肺和外周组织进行了单细胞转录组测序。经实验分析共捕获208506个细胞，确定了三个主要 B细胞亚群，包括滤泡B细胞、生发中心B细胞和浆细胞（图2A）。滤泡B细胞高表达CD83、CD69、SELL和BANK1；浆细胞高表达多种免疫球蛋白转录物（IGHG2、IGHGP和IGHA2）、MZB1、DERL3和XBP1；生发中心B细胞高表达HMGA1、AICDA和RGS13（图2C）。在两个独立的NSCLC的scRNA-seq数据集中验证了这三类细胞的存在（图2D和2E），并使用CyTOF在蛋白质水平上进一步证实了这三个B细胞亚群的存在。

图2 非小细胞肺癌中三种B细胞亚群的鉴定

3. 高度特异性的浆细胞表达特征可用于bulk RNA-seq分析

为了探究scRNA-seq分析中确定的B细胞亚群表达特征是否可以预测阿替唑单抗治疗或多西紫杉醇化疗后的患者生存率（OS）。研究者首先通过基因共表达分析和层次聚类结果，发现单细胞转录组分析确定的B细胞亚群表达特征可以应用于bulk RNA-seq数据分析（图3 A）。又对23例NSCLC肿瘤组织进行了配对的bulk RNA-seq和mIF分析（图3 B），结果发现，RNA-seq或mIF对浆细胞的定量具有高度相关性（图3 C）；对样本进行二分后得到了相似的分层（图3D）。此外只有浆细胞的标记基因与mIF浆细胞定量相关，而滤泡B细胞和生发中心B细胞的标记基因与mIF定量不相关。以上结果证明了单细胞转录组分析确定的B细胞表达特征中的浆细胞具有高度特异性，并能应用于bulk RNA-seq来对样本进一步分层。

图3 B细胞亚群特征在bulk RNA-seq中的应用

4. 高浆细胞特征预测阿替唑单抗治疗后的患者生存率增加

然后，研究者使用三分位数对患者进行二分类，通过Kaplan-Meier对T3类和T1/2类进行比较分析。结果发现，虽然阿替唑单抗在三个B细胞特征中都观察到OS改善的趋势，但只有浆细胞信号显著（图4A-4D）；并且无论是生发中心B细胞、滤泡B细胞，还是tGE8特征（IFNG、 CXCL9、CD8A、GZMA、GZMB、CXCL10、PRF1和TBX21），都在这些模型中不显著（图4E）。

为了进一步评估浆细胞特征对免疫检查点抑制剂治疗反应的预测价值和独立性，研究者对207名患者（阿替唑单抗 n=99；多西紫杉醇 n=108）采用PD-L1 IHC、RNA-seq和组织TMB进行了全面的生物标记物分析，并与多因素Cox比例风险分析相结合。结果发现，浆细胞特征对阿替唑单抗治疗组中的OS有最强的影响，且高浆细胞特征的肿瘤患者仅在阿替唑单抗治疗组中临床获益率显著增加（图4H），而在多西紫杉醇化疗组中没有这些相关性，这突出了浆细胞特征的特异性（图4F）。

图4 浆细胞信号可独立预测对Atezolizumab的应答率

5. 浆细胞特征在具有三级淋巴结构(TLS)和/或淋巴聚集（LAs）的肿瘤中富集

前人在TLS中发现了肿瘤内B细胞。因此，研究者评估了基线肿瘤H＆E玻片中TLS或淋巴聚集物（LAs）的存在情况，并通过RNA-seq和mIF比较TLSs和LAs在细胞表型水平上的差异。结果发现，TLS以CD20+ B细胞为主的独特生发中心为标志，其中生发中心被CD20+ B细胞和CD3+ T细胞的混合物包围（图5A）。此外，所有已识别的TLS均由邻近的浆细胞标记，并在LAs内或周围也发现浆细胞（图5A）。为了进一步探究浆细胞与其他细胞类型之间的关系，研究者进行了mIF实验，实验证明浆细胞浸润可能与TLS或LAs中的T细胞浸润有关。

研究者又进一步探究在POPLAR随机II期临床试验中肿瘤的H&E玻片是否存在TLS和/或LAs。结果发现，在254例患者样本中，9%的患者有TLS样结构，21%的患者有LAs；并发现含有TLS和/或LAs的肿瘤患者在使用阿替唑单抗治疗时，OS有显著增加，但使用多西紫杉醇化疗时没有显著区别（图5C）。这表明TLS和/或LAs的存在与阿替唑治疗（而非多西紫杉醇化疗）患者的OS获益密切相关，这一特征与浆细胞特征相似。研究者又对TLS/LA+和TLS/LA-的肿瘤组织进行了DE-Gs分析，发现含有TLS和/或LAs的肿瘤中三种瘤内B细胞亚群的基因高度富集，尤其是浆细胞基因，包括MZB1、TNFRSF17（BCMA）和免疫球蛋白（图6A和6B）。对三种B细胞特征的定量分析证实了TLS和/或LAs的肿瘤中浆细胞数量增加（图6C）。

图5 含有TLS和/或LAs的肿瘤患者使用阿替唑单抗治疗可改善OS

图6 含有TLS和/或LAs的肿瘤富集浆细胞

小编小结

总的来说，该研究整合了阿替唑单抗免疫检查点抑制剂治疗与多西紫杉醇化疗两个大型随机临床试验的bulk RNA-seq队列，以及scRNA-seq和蛋白质测量实验，结果表明，NSCLC中高水平的瘤内浆细胞与接受阿替唑单抗治疗的患者更长的OS密切相关，可以作为一种新的免疫检查点抑制剂治疗的预后标志物。

中科优品推荐

【中科新生命】重点布局单细胞多组学平台，先后建立了基于10x Genomics 最新Chromium X的单细胞转录组测序平台以及“一站式”单细胞蛋白质组服务平台。其中，Chromium X作为当前业内通量最高的单细胞测序平台之一，可以实现百万级细胞通量检测，为大规模单细胞图谱、高通量药物筛选、稀有细胞鉴定分析等需求提供助力。