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Pyrosequencing技术在遗传疾病诊断中的常见问题及解决方法

2020.9.14

目前，Pyrosequencing技术被越来越多的应用于临床快速分子诊断，如通过Pyrosequencing技术检测 MTHFR编码基因的C677T位点的基因型，作为成年人冠心病和中风的辅助诊断手段；通过检测ApoE基因上的SNP112和SNP158，作为阿滋海默征的辅助诊断手段；对人基因组上15q11-13区域的甲基化状态进行检测，这作为临床上普－威综合症和安格尔曼综合症的诊断手段；对MLH1基因－248至227中四个甲基化位点的定量检测，计算这些位点的甲基化称度，这可作为临床上结肠癌、子宫内膜癌、胃癌的辅助诊断方法；定量测定P16基因－24至－11中的四个甲基化位点的甲基化程度，这作为非小细胞型肺癌、结肠癌、淋巴癌和膀胱癌的辅助诊断手段。使用Pyrosequencing技术对微生物 16S和23S rDNA特定序列分析可以鉴定结合杆菌，幽门螺旋杆菌等多种临床相关的微生物，可以通过检测 rpoB等基因特定序列来判定微生物的耐药性。
本文以Pyorsequencing用于临床上普－威综合症和安格尔曼综合症的诊断为例，详细说明实验的操作，并对实验中遇到的常见问题和解决方法进行讨论。

普-威综合征（Prader-Willi syndrome, PWS）和安格尔曼综合征（Angelman syndrome, AS）是两种临床症状和遗传形式不同的遗传疾病，但是，两者的致病因素都与15号染色体长臂11-13区（15q11-13）印记基因聚集区有关。使用Pyrosequencing对15q11-13 Pyrosequencing 技术在遗传疾病诊断中的常见问题及解决方法区域的小核蛋白多肽N基因（SNRPN）在父本和母本遗传的甲基化程度的差异分析，可以用来辅助诊断普- 威综合征和安格尔曼综合征。
实验步骤：
一、重亚硫酸盐处理病人DNA样本
获得临床病人的D N A 样本后，使用E Z D N A Methylation Kit (Zymo Research)试剂盒来处理样本，每个样本的用量为2μg，按试剂盒的标准protocol 进行操作，最终使用10μl洗脱缓冲液洗脱DNA。通过重亚硫酸盐试剂处理后，DNA序列上甲基化的C由于甲基的保护，不发生脱氨基反应，非甲基化的C发生脱氨基反应变成U，而PCR后U位点转换为T，所以最终甲基化的CG位点变成潜在的C/TG多态位点。对于非 CpG位点上的C，它们一般情况下是不会被甲基化的，所以重亚硫酸盐处理PCR后，这些位点应该全部转变成 T，这些位点可以作为重亚硫酸盐处理是否完全的内在质控。
二、设计Pyrosequencing反应的引物， PCR
使用Biotage AB公司的Assay Design Software 设计针对SRNPN位点的PCR引物和测序引物，设计的 PCR引物如下：
PCR做50μl体系，具体体系如下：正向引物和反向引物各10pmol，10X Buffer 5μl，dNTP 1μl， HotStar DNA Polymerase（Qiagen）0.3μl，重亚硫酸盐处理后的DNA样本20ng，用纯水补足至50μl。

PCR条件如下：95℃ 15min，50循环（94℃， 30s；58℃，30s；72℃，30s），72℃延伸5min，最后保存在15℃。
两对P C R引物配合3个测序引物，可以检测1 2 个甲基化位点，引物A1031F 和A1032RB 用来做 pyrosequencing分析 1033 (甲基化位点G至J)，引物 A1035FB和引物A1036R用来实验1037（甲基化位点R 到U）和1038（甲基化位点C-F）。
三、单链分离纯化
按照Biotage AB厂家的说明，使用Vacuum Prep tools来进行生物素标记PCR产物单链的分离，分离得到的单链释放到45μl含有0.3μM测序引物的退火缓冲液中，80℃变性2min，自然冷却到室温。
四、Pyrosequencing反应及结果分析

按照厂家的说明，使用PyroGold Reagent Kit进行实验，实验中针对不同测序引物输入的Sequence to analyse见上面表格，输入序列后由软件自动获得加入 dNTP的顺序。各甲基化位点的甲基化程序使用AQ软件来分析。上图就是采用1035FPB和1036R这对PCR 引物，1037RSeq这个测序引物进行实验的定量分析结果。

其中结果（i）代表的是安格尔曼综合征患者DNA 样本的的检测结果，结果（ii）正常人样本DNA的检测结果，结果（iii）代表的是普-威综合征患者样本DNA 的检测结果。图中五角星标志的多态位点是重亚硫酸盐处理内部质控的位点，腺嘌呤A的100％表示实验的重亚硫酸盐处理完全。通过对SRNPN基因上的12个甲基化位点的定量分析，就可以对临床病例进行这两种疾病进行诊断。
各实验步骤中可能存在的问题以及解决办法
一、重亚硫酸盐处理病人DNA样本
重亚硫酸盐的处理对后面实验结果的判定非常关键，如果重亚硫酸盐对非甲基化的胞嘧啶处理不完全，会有很多非甲基化的C没有转变成T，结果显示的甲基化水平就会比实际的要高，严重影响实验结果的正确性。实验中，非CpG位点上的C可以作为重亚硫酸盐处理是否完全的内部质控，对于非CpG位点上的C作为C/ T多态位点进行定量分析，其T的频率应该为100％，或者在反向检测时A/G的多态位点上的A频率应该为 100％，如果这些频率小于100％，那就表明前期的重亚硫酸盐处理不完全，需要优化处理的条件。

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周锦帆