制备用于LC-MS实验的Hela细胞胰酶分解的肽段混合物
实验概要
本方法的目的是从HeLa培养细胞中制备胰蛋白酶分解肽的混合物，这一混合物样品的主要用于评估，优化和验证LC-MS/MS程序。
主要试剂
丙酮，Sigma-Aldrich公司(易燃，处理通风柜和戴手套和安全的护目镜)。
碳酸氢铵，Sigma-Aldrich公司
β-甘油，Sigma-Aldrich公司
糜酶抑素，Sigma-Aldrich公司
DL-二硫苏糖醇(DTT)，Sigma-Aldrich公司
二甲基亚砜(DMSO)，Fluka公司
乙二胺四乙酸(EDTA)，甘油，BioChemika
高糖DMEM培养基，(Sigma-Aldrich公司)
10%(V / V)胎牛血清(Gibco公司)
碘乙酰胺，Sigma-Aldrich公司(有毒和腐蚀性)
默克亮肽素，Sigma-Aldrich公司
氢氧化钾，氯化钾，Sigma-Aldrich公司
L-谷氨酰胺，Sigma-Aldrich公司
赖氨酸- C，Wako Chemicals
Nocodazole，Sigma公司
实验步骤
1. HeLa细胞蛋白质的制备
1)HeLa-kyoto细胞培养于DMEM中，并用nocodazole过夜处理来抑制生长。
2) 用刮刀收取细胞，并用PBS洗3次。一个托盘(25厘米×25厘米，100毫升介质)能产生约4毫克的蛋白质。
3)将细胞悬液加入至两倍体积的裂解缓中，并通过细针来抽吸液体破坏其细胞膜。4℃，500 g低温离心15分钟，收集蛋白。
2. 丙酮沉淀蛋白质
1) 加入5倍体积的冰丙酮至蛋白溶液，零下30°C孵育。
2) 4℃，500 g低温离心30分钟。
3) 弃上清，将蛋白质沉淀与80％的冰丙酮仔细混匀，4℃，500 g低温离心30分钟。
4) 将蛋白沉淀晾干(避免完全干燥)，将沉淀溶解于消化缓冲液中(8 M尿素，0.5 M碳酸氢铵)，调整蛋白浓度为5 µg/µL。(注：蛋白质溶液pH值应该为8.0。在我们的实验室中，用Bradford法测定蛋白浓度)。
3.还原和烷基化蛋白质
1) 向蛋白溶液中0.05 µg的DTT，56℃孵育30分钟，持续振荡。
2) 向其中添加碘乙酰胺，使其终浓度为每µg蛋白中含0.25 µg，黑暗中室温孵育30分钟。
3) 加入DTT原液至终浓度为每µg蛋白含0.25 µg，停止反应。
4.赖氨酸- C消化
1)将样品溶解于6 M尿素(含50 mM碳酸氢铵)缓冲液，并添加赖氨酸-C使其终浓度为每50 µg蛋白含1 µg。
2) 30℃孵育2小时，将溶液稀释至0.8 M尿素含50 mM碳酸氢铵。
3) 每60μg蛋白中加入1µg的胰蛋白酶，37℃孵育2小时。
4) 向样品中再添加等量的胰蛋白酶，37℃孵育过夜，加入 TFA进行酸化，使样品的pH值为2来终止消化。
5) 将多肽混合物等量分装，并存储在零下80摄氏度环境中。
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