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知识分享：稳转株的制备

2020.8.25

　　实验原理：

　　利用哺乳动物系统生产蛋白的方式有两种：瞬时转染和稳转株筛选。通过稳定细胞系构建筛选稳定表达细胞株。针对瞬时转染，外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量较少，能够满足小量蛋白制备，大量生产成本很高。相对于此，稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定转染表达，同时经过抗生素加压筛选，最终得到能够稳定转染表达蛋白的细胞株，稳转株生产蛋白稳定性更好，批次差异性更小。

　　稳定转染的应用

　　稳定转染适用原因

　　稳定转染应用

　　外源基因要整合到细胞染色体上

　　基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究

　　细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰

　　单克隆稳转株筛选

　　外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失

　　需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞

　　一些蛋白稳定性很强，瞬时 RNA 干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白

　　需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果

　　稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究

　　在某些细胞中长期研究基因的功能

　　通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段

　　获得外源片段的高效表达

　　避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞

　　得到过表达的目的基因或干扰拷贝数

　　影响稳定转染的因素

　　1、外源基因整合的几率

　　决定了稳转株筛选的简易程度，有利于稳定转染细胞的获得；

　　2、插入外源基因片段的拷贝数

　　一般情况下，低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；

　　3、整合位点转录活跃度

　　整合位点转录活跃度决定了稳转株筛选细胞后稳转株中外源基因片段的表达质量；

　　4、外源基因片段整合到细胞后的稳定性

　　不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象。

　　制备稳转株的实验步骤

　　一．准备及预实验

　　1、确定细胞系相关信息：需包括如下内容

　　细胞系名称

　　细胞培养条件

　　细胞增殖速度

　　支原体污染情况

　　注：务必保证细胞无支原体污染，方可进行稳转株构建！

　　2、查阅慢病毒感染该细胞的MOI值

　　3、预实验确定筛选药物用量：

　　（1）查阅Puromycin/Blastincidin在目的细胞中稳转株筛选的致死用量信息；参考查阅得到的数据，确定3个药物浓度梯度（如没有相关信息，则需将药物浓度梯度范围增大，数量增多至6个）；

　　（2）D0将细胞铺于6孔板中，使D1细胞融合度约90%；D1按（1）中设置的药物梯度，加入药物；

　　（3）D4换液，并重新加入药物；

　　（4）D7观察，找到致死率100%的孔，该孔使用的药物浓度，即为药物筛选浓度。

　　二．稳转株筛选及构建

　　注：以下实验参数，按1株稳转株为例描述，实验需考虑有无对照稳转株！

　　1、细胞铺板：D0将细胞接种于6孔板中（4个孔），使D1细胞融合度约70%

　　病毒感染：

　　2、慢病毒上清：分别弃去6孔板中3个孔的0.5毫升培养基、1毫升培养基、2毫升培养基和，分别加入2毫升慢病毒上清、1.5毫升慢病毒上清和0.5毫升慢病毒上清；

　　3、纯化慢病毒：选3个孔，并可按推荐MOI、大于此MOI及小于此MOI，共三个MOI值，添加慢病毒；

　　4、观察感染效率：感染后72小时，观察感染效率，效率高于80%最佳，最低不应低于40%，选择1-2个感染效率较好的孔。

　　5、筛选：

　　(1)多克隆稳转株：从感染72小时后开始于6孔板中加筛选药物，每隔2天，重新换液加入药物。药物筛选需至少持续14天，直至显微镜下观察荧光细胞比例为100%。

　　注：第一次加入药物时在上午进行，4-6小时后观察细胞状态，如细胞死亡过多，需更换新鲜不含药物的培养基。

　　(2)单克隆稳转株：建立在获得多克隆稳转株基础上。

　　A、有限稀释法：

　　a.取24个1.5毫升EP管，每管中加入800毫升完全培养基；

　　b.用胰酶将多克隆稳转株消化（90%融合度，10毫升培养基终止消化），取80微升至第一个EP管中，混合均匀；

　　注：应使用1000微升枪尖，混合时不要过度吸打，以免破坏细胞。

　　c.从第一个EP管中取80微升至第二个EP管中，混合均匀，以此类推。

　　d.将EP管中的细胞悬液，以每孔100微升，接种于96孔板中；

　　e.过夜培养后，观察第12-24列，寻找只含有1个细胞的孔，并做好标记；

　　f.培养3-4周，待标记孔中细胞扩增后，消化传代扩增，即为单克隆稳转株细胞。

　　注：培养的第一周不要换液，接下来每3-4天换液。

　　B、平板挑取法

　　a.计数100个多克隆稳转株细胞，接种于一个10cm培养盘中；

　　注：尽量吹打均匀，防止细胞聚团。

　　b.过夜培养后，观察并寻找单个细胞的位置，并在盘底做标记；

　　c.培养2周；

　　注：培养的第一周不要换液，接下来每3-4天换液。

　　d.待标记处的细胞扩增为肉眼可见的白点，使用10微升移液器，调至最大量程，在尖端吸取一点胰酶（约5微升，且尖端为空气），缓慢滴至白点处，保持枪尖静置在白点上，且不让胰酶留出白点所在范围，1min后，迅速吹打，将消化下的细胞转移至96孔板中，传代扩增，即为单克隆稳转株细胞。约需2-3周。

　　注：每盘选取20个为宜，在消化时，需按照先消化边缘的，再消化中心的原则，防止克隆之前的相互污染。培养的第一周不要换液，接下来每3-4天换液。

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周锦帆