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在读板机上进行基于时间分辨荧光标记的Western ...(一)

2020.6.16

在读板机上进行基于时间分辨荧光标记的Western Blot蛋白检测和定量


摘要

蛋白检测在制药和临床研究领域是一项非常重要的项目,而Western Blot(WB)检测则是众多蛋白检测方法中最常见的一种。目前,检测转印到WB膜上蛋白的技术众多,包括荧光标记、银染和化学发光法等。可是,每一种技术都有其局限,人们一直致力于寻找提高WBs定量准确度和动态检测范围的技术方法。这里,介绍一种最新的在SpectraMax i3或Paradigm多功能酶标仪上检测WBs膜的蛋白分析方法。膜上使用铕元素-螯合物或链霉素标
记二抗特异结合被研究的蛋白。铕元素标记具有长荧光寿命周期,可至1ms级别,所以荧光的检测采用时间分辨的模式,从而可以减少来自于自发荧光和其他短寿命周期的杂光的背景。WBs膜被置于酶标仪内,然后使用TRF卡盒进行WBs膜优化扫描。此方法不涉及酶的检测,加之铕元素-螯合物标记物具有很强的光漂白抗性,因而信号十分稳定能至几周到几个月,这就允许对膜进行重复扫描以及可能进行不同条带的强度对比以及根据标品进行更精确的定量。TRF检测方式采用单光子计数模式,所以理论的动态检测范围为>105。实际应用中,动态检测范围则受限于高含量条带的荧光饱和以及非特异性结合造成的背景因素。由于不使用CCD不会出现高光溢出现象,而这却是化学发光和普通荧光检测的常见问题,所以此方法能够提供非常锐利的条带和出色的图像质量。这一新颖的多功能酶标仪检测平台上的Sc a n l a t e r  Western Blot检测系统以其操作简便、检测灵敏和信号的超高稳
定性,提供了出色的WBs检测性能表现,必将给多功能酶标仪在实验室应用方面带来又一重大突破!

原理

ScanLater Western Blot检测系统简化了Western Blot的流程,二抗使用铕元素-螯合物标记物,扫描在酶标仪上进行。不需要底物,膜洗涤后直接进行扫描检测。铕元素具有长荧光寿命周期,至1ms,检测模式使用时间分辨模式(TRF),可以极大减弱自发荧光和其余短寿命背景杂光。

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Figure 1. 上左:蛋白检测示意图。二抗直接使用铕元素标记。上右:铕元素-螯合物激发和发射光谱。下右:TRF检测模式,铕元素的荧光周期与背景荧光的衰减周期对比,信号的检测采取一定时间延迟,从而去除背景荧光干扰。

材料与方法

材料
• Scanlater Western Blot试剂盒(10X Washing Buffer, 5X Blocking Buffer, Eu-Labeled Anti-Mouse IgG, Eu-Labeled Anti-Rabbit IgG, Eu-Labeled Streptavidin),由Molecular Devices, LLC.提供。
• Western Blot膜使用SpectraMax Paradigm或SpectraMax i3 多功能读板机进行扫描(Molecular Devices)。
• 谷胱甘肽S-转移酶(GST), 生物素化兔抗GST, 鼠抗-GST, 兔抗转铁蛋白,转铁蛋白(Abcam)。化学发光底物和HRP-二抗(Millipore)。
• TGX 4-20% 胶,双标记蛋白标品,电泳缓冲液,上样缓冲液,转印缓冲液,蛋白转印系统(Bio-Rad Laboratories), Immobilon FL膜(Millipore)。

方法
• 在200V电压下,蛋白于TGX 4-20%中,跑胶30min,之后使用Trans Blot Turbo电转印7min到PVDF膜上,然后使用TBST漂洗30s,再用1X封闭液封闭1h。
• 一抗以一定比稀释比例直接加到封闭液中,室温下放置2小时或4℃过夜,1X洗液洗膜三次,每次5min。
• 二抗按照1:5000使用1X封闭液进行稀释,然后加到膜上孵育60min,然后1X洗液洗膜三次,每次5min,最后在去离子水中漂洗15s,晾干准备进行扫描。
• 在SpectraMax Paradigm或 SpectraMax i3多功能读板机上进行扫描检测,使用SoftMax® Pro软件进行分析。

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