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cccDNA的定性检测

2023.3.10

既往绝大多数文献报道的是用Southern blot对cccDNA进行定性检测,该方法是分子生物学的经典方法,但技术要求较高,敏感度低。

近年来,也有较多文献报道用PCR技术对cccDNA进行检测。但是,由于PCR技术灵敏度极高,rcDNA和cccDNA的序列又具有高度的同源性,因此在用PCR技术检测cccDNA时,必须确保只能扩增cccDNA而rcDNA不被扩增。利用rcDNA和cccDNA结构上的差异可以解决这一问题。由于rcDNA的正链和负链上均存在缺口,故可以设计跨越两个缺口的引物,使rcDNA不会被扩增,而cccDNA由于是完整的双链结构则可以被选择性扩增。同时可设计另一对不跨越缺口的引物或只跨越一条链的缺口的引物同时检测cccDNA和rcDNA。Kock等成功地用这种选择性PCR的方法在检测感染细胞内的cccDNA和rcDNA。

此外,为进一步提高检测的灵敏度,可用套式PCR(nested PCR)的方法。

但是有报道认为跨缺口引物对两种DNA的选择性不是绝对的,在PCR检测cccDNA时,起始模板量不能过高,否则rcDNA也有可能被扩增,Kock等发现每个PCR反应管中HBV DNA的量在1pg(约6×105拷贝)时能达到最佳的灵敏度与选择性,因此在分析前应估计标本中HBVDNA的量。虽然套式PCR更为灵敏,但由于需取PCR产物进行再次扩增,因此在操作中要注意防止PCR产物污染,避免假阳性。


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