抗原呈递细胞的选择和制备(一)
基本方案 过 利 斯 特 氏 菌 刺 激 制 备 腹 腔 巨 噬 细 胞
材 料
单核细胞增多性利斯特氏菌
无 菌 PBS
H -2 相 合 小 鼠(见 表 A .2A .1),包括正常和提前 3 周注射了利斯特氏菌的小鼠
V冰浴的 D M E M 培养基
3 % (V A O 乙酸
0.4% (m /V ) 台盼蓝染液
V D M E M -1 0 完 全 培 养 基(室温以及 37°C )
7 0 % (V7 V ) 乙醇
IOml 和 30m l 的注射器以及 23 G 针头
离心机
9 6 孔培养板
移液器
显微镜
1 . 在 50m l 离心管内将利斯特氏菌用 P B S 稀释至合适浓度,此 时 0.5〜1.0m l 菌液中含半数致死量 5 % 〜1 0 % 的 细 菌(一 般 情 况 下 C B A /J 小 鼠 或 C 57B L / 6 小 鼠 需 IO5 个细菌/m l , B A L B /c 小鼠需 IO4 个细菌/ml)。盖紧离心管盖后摇匀。用 IOml 注射器抽取稀释过的上清。
2 . 用 23 G 针 头 将 0.5〜1.0m l 细菌悬液注射人 H -2 相合小鼠腹腔。根 据 步 骤 6 计算出制备足够用细胞所需小鼠数量。
3.7〜Ild 后 收 集 腹 腔 细 胞(单 元 6.1)。用 冰 浴 的 D M E M 收集细胞以防止巨噬细胞黏附在管壁上。
4 . 将收集的细胞悬液置于 50m l 离心管, 4°C , 400〜500 g 离 心 lOmin,收集细胞并重悬于 0.5m l 预 冷 的 D M E M 中。
5 . 吸取少量细胞悬液并以 1 : 5 (W F ) 悬 浮 于 3 % 的乙酸溶液中,以溶解红细胞。加入等量的台盼蓝染液并计数活细胞(见 附 录 3C ,细胞数量应达到 I X l O 7〜2 X 107 个
细胞/ml)。
6 . 在离心管内加入 D M E M -1 0 完全培养基,将细胞浓度调节至 2X 106个细胞/m l 。如果血清浓度达不到 8 % 〜9 % ,可离心细胞弃上清后直接用 D M E M -I O 完全培养基稀释
至 2 X 106 个细胞/ml。将腹腔细胞转移至 9 6 孔培养板培养, IOUl/孔(2 X 105个细胞/孔)。
7.37°C 培 养 2 h 或 稍 长 时 间(但不可过夜)以便巨噬细胞贴壁。
8 . 用多道移液器反复轻柔地吹打细胞,吸弃悬浮细胞后加入 37°C 预 热 的 D M E M -I O 完全培养基。注意操作宜轻柔且不能触碰到贴壁细胞。
9 . 在显微镜下检查细胞。分离的细胞若在 I d 内使用,就无需用 IFN-7 进一步活化。
备 选 方 案 1 连续注射利斯特氏菌和豚蛋白胨后制备腹腔巨噬细胞
此法可以较前法制备更多数量的小鼠腹腔巨噬细胞,但需要给小鼠多注射一次,且需要在更短的时间内收集巨噬细胞。此过程与前述基本方案基本相同,只是在初次注射细 菌 7〜IOd 后 ,直接给小鼠腹腔一次性注射 I m l 高压灭菌消毒的溶解于水的 1 0 % (V /V )豚蛋白胨。 3d 后如前述收集细胞(见基本方案,步 骤 3〜9)。
辅 助 方 案 1 小鼠腹腔注射用利斯特氏菌的制备
材 料
4 只 小 鼠(如 C B A /J)
培养单核细胞增生性利斯特氏菌(见 单 元 6. 6)
无 菌 PBS
I O O m m 无菌脑心浸液琼脂板
无菌脑心浸液培养基
细菌冻存液:溶 解 于 P B S 的 2 0 % (V /V ) 甘油,蒸汽消毒后 4°C 保存
70um 无菌尼龙滤网
50m l 离心管
无菌细菌涂布器
37°C 培养箱
无菌接种环
560n m 分光光度计
高速离心机以及无菌带盖离心管
Sorvall R C -5 离心机及 G S A 转子
I m l 冻存管
1 . 将适量利斯特氏菌注射至 2 只小鼠腹腔,以便通过体内途径获得利斯特氏菌并确保其毒力。如 对 于 C B A / J 小 鼠 ,可 使 用 IO6 个细菌/鼠。 2d 后处死小鼠,取出脾脏并制备脾细胞悬液,通 过 70 Mm 无菌尼龙滤网后将细胞置于 50m l 离心管。另 取 2 只小鼠作为对照。
也可以不通过体内传代,直接从脑心浸液琼脂板挑取利斯特氏菌克隆,参照步骤 3 接种至脑心浸液肉汤。
2.用 P B S 梯度稀释脾细胞悬液(1 : 10、 1 : 100、 1 : 1 0 0 0 ) 并 将 IOOm I 各组稀释细胞悬液分别置于 I O O m m 无菌脑心浸液琼脂板,用无菌细菌涂布器将细胞涂布均勻。置于 37°C 培养箱培养过夜。计数每块培养板的克隆数。确认涂布对照小鼠脾细胞板不形成克隆,且涂布实验小鼠脾细胞板形成大量克隆(对 于 1 : 1 0 0 稀释的细胞,每块培养板应获得 10〜100 个克隆)。
3 . 用接种环从培养板挑取 4 个 典 型 克 隆 并 分 别 转 移 至 20m l 无菌脑心浸液培养基中(50m l 离心管)。注意每次挑取克隆时接种环均需灭菌。加盖混匀。
4a. 制备当天细菌培养物:将 试 管 置 37°C 培养,每 30m i n 摇动一次。 3 h 后 ,定 时(比如每小时)取少量菌液通过分光光度计检测其 O D 值 。当 O D 值均达到 0.17 时停止培 养(约 需 4 h),从中取一管再扩增。
4b. 制备隔夜细菌培养物:将 试 管 于 37°C 静 置 培 养 过 夜(试管盖无需盖紧)。第二 天 ,将试管内的菌液以 1 : 1000 稀释至无菌脑心浸液培养基,培 养 至 O D 值 达 到 0.5〜1.0 (约需 8 h)。
5 . 将菌液置 4°C 保 存(每 份 0.5 ml)。如方便,可于第二天确认培养物中是否含有利斯特氏菌。此外 ,利斯特氏菌能在 4°C 存活并扩增。对于隔夜培养的细菌,进 入 步 骤 7操作。
6 . 经过筛选后,将含有细菌的 15〜130m l 脑心浸液培养基转移至无菌高速离心管,将其固定在摇床的样品架上,在 37°C 缓慢摇动培养,定时检测 O D 56c 5 值 ,并 在 O D 56。值达 到 0.5〜L O 时 停 止 培 养(约 需 5 h)。
7.700g离 心 细 菌 6 min。在此过程需非常小心:因为培养物里含有大量细菌。将细菌悬 浮 于 IOml 冻存液中。
8 . 检测细菌的 O D 56。值(可 通 过 1 : 2 0 稀释后检测),将细菌的浓度调节至 I X l O7〜IO8个细菌/ml (O D 56。值 为 1 时细菌量约为 5 X 108)。将 细 菌 分 装(0.1〜Iml) 保存于一80°C ,可以保存 3 年以上。每次解冻后使用,应避免反复冻融。
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