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免疫治疗新靶点-TNFR2

2020.8.24

　　在这个草长莺飞的春天，是否记得那句“要想富，多栽树”的宣传标语？今天的植树节，百奥赛图知识拓展课堂携智慧树如期而至，与您携手探寻TNFR2。

　　基本信息

　　基因功能简介

　　TNFRSF1B（TNF receptor superfamily member 1b）为TNF受体超家族成员, 也称为TNFR2，主要表达在肿瘤微环境中的Treg细胞和多种肿瘤细胞中（如卵巢癌和肠癌）。其配体TNF主要识别TNFR1进行凋亡，依赖TNFR2进行与T细胞存活相关的功能——通过NF-κB信号促进pro-survival基因的转录，从而促进细胞增殖和生存。许多实验表明阻断型抗体可以特异性杀伤肿瘤微环境中的Treg细胞和肿瘤细胞，用于治疗多种肿瘤；而激活型抗体可以激活Treg细胞，进而抑制Teff细胞，从而治疗自身免疫疾病，为免疫治疗提供了新的靶点。

　　信号通路

　　TNFR1和TNFR2介导了不同的信号和作用[1]

　　表型分析

　　B-hTNFR2小鼠mRNA表达分析

　　通过RT-PCR对WT和B-hTNFR2小鼠中TNFR2基因表达进行品系特异性分析。在C57BL/6小鼠中可检测到mTNFR2 mRNA，而hTNFR2 mRNA仅在B-hTNFR2纯合鼠中检测到。

　　采用RT-qPCR对WT和B-hTNFR2小鼠的TNFR2基因表达进行品系特异性分析。

　　B-hTNFR2纯合鼠中hTNFR2的mRNA表达与野生鼠C57BL/6相似，说明用B-hTNFR2小鼠人源化小鼠模型并没有改变TNFR2蛋白的表达水平。

　　B-hTNFR2小鼠蛋白表达分析

　　通过流式细胞术对野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠中TNFR2蛋白表达进行分析。用抗小鼠CD3ε抗体体内刺激野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠，收集脾细胞，并用种属特异性抗TNFR2抗体进行流式细胞术分析。结果显示：在C57BL/6小鼠B细胞表面检测到mTNFR2，在B-hTNFR2纯合鼠B细胞表面检测到hTNFR2。

　　通过流式细胞术对野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠中TNFR2蛋白表达进行分析。用抗小鼠CD3ε抗体体内刺激野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠，收集脾细胞，并用种属特异性抗TNFR2抗体进行流式细胞术分析。结果显示：在C57BL/6小鼠T细胞表面检测到mTNFR2，在B-hTNFR2纯合鼠T细胞表面检测到hTNFR2。

　　通过流式细胞术对野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠中TNFR2蛋白表达进行分析。用抗小鼠CD3ε抗体体内刺激野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠，收集脾细胞，并用种属特异性抗TNFR2抗体进行流式细胞术分析。结果显示：在C57BL/6小鼠Treg细胞表面检测到mTNFR2，在B-hTNFR2纯合鼠Treg细胞表面检测到hTNFR2。

　　B-hTNFR2小鼠的白细胞亚群分析

　　从C57BL/6和B-hTNFR2小鼠（n=3）中分离出脾细胞。通过流式细胞术测试白细胞亚群的比例。

　　结果表明，纯合B-hTNFR2小鼠中白细胞亚群的表达谱与C57BL/6小鼠相似，hTNFR2的人源化不影响T，B，NK，粒细胞，单核细胞，DC和巨噬细胞的分化。

　　从C57BL/6和B-hTNFR2小鼠（n=3）中分离出脾细胞。通过流式细胞术测试白细胞亚群的比例。结果表明，纯合B-hTNFR2小鼠中白细胞亚群的表达谱与C57BL/6小鼠相似，hTNFR2的人源化不影响CD45细胞中mCD4、mCD8以及T细胞中mCD4、mCD8的分化。

　　从C57BL/6和B-hTNFR2小鼠（n=3）中分离出淋巴结细胞。通过流式细胞术测试白细胞亚群的比例。结果表明，纯合B-hTNFR2小鼠中白细胞亚群的表达谱与C57BL/6小鼠相似，hTNFR2的人源化不影响T，B，NK细胞的分化。

　　从C57BL/6和B-hTNFR2小鼠（n=3）中分离出淋巴结细胞。通过流式细胞术测试白细胞亚群的比例。结果表明，纯合B-hTNFR2小鼠中白细胞亚群的表达谱与C57BL/6小鼠相似，hTNFR2的人源化不影响CD45细胞中mCD4、mCD8以及T细胞中mCD4、mCD8的分化。

　　TNFR2抗体与B-hTNFR2纯合鼠T细胞结合分析

　　从B-hTNFR2小鼠（n=3）中分离出脾细胞。通过流式细胞术测试TNFR2抗体与脾细胞的结合。

　　从anti-mCD3ε(0.2或1μg/mL)和anti-mCD28(1μg/mL)体内刺激的B-hTNFR2小鼠分离出脾细胞。单个活细胞用CD45圈门后用于进一步的分析。如图所示，与同型对照抗体(hIgG)相比，hTNFR2 Ab2与B-hTNFR2纯合鼠的T细胞是结合的。在anti-mCD3ε(0.2μg /mL)刺激条件下，mTNFα增强了hTNFR2 Ab2与B-hTNFR2纯合鼠的T细胞结合，这表明mTNFα/hTNFR2信号通路在B-hTNFR2纯合鼠中是可行的。

　　TNFR2抗体药效验证

　　将鼠结肠癌MC38细胞皮下植入纯合的B-hTNFR2小鼠中，当肿瘤体积达到约100 mm3时，对小鼠进行分组，然后使用抗人类TNFR2抗体进行治疗。与对照组相比，两种人TNFR2抗体以不同程度抑制肿瘤生长，证实B-hTNFR2小鼠模型是体内TNFR2抗体药理功效研究的有力工具。（A）肿瘤平均体积±SEM，（B）小鼠平均体重±SEM。

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周锦帆