凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量实验_凝胶过滤层析法
凝胶过滤也称排阻层析、分子筛层析和凝胶层析。本实验目的是了解凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量的基本原理,巩固柱层析的操作方法。
实验方法原理 | 凝胶过滤( Gel Filt ration ) 也称排阻层析( Exclusion Chromatography)、分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography ) 和凝胶层析( Gel Chromatography) 。凝胶一般是由葡聚糖的胶体溶液凝结而成的固体物质, 其内部具有很细微的多孔网状结构。凝胶层析的机理是分子筛效应, 当凝胶装柱后, 柱床容积称为“ 总容积” ( Vt ) , 它由Vo、Vi 、Vg 三部分组成, Vt = Vo + Vg ,式中Vo 为“外水容积”, 或“ 孔隙容积”, 即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相容积; Vi 为“ 内水容积” 即凝胶颗粒内部所含水相的容积, 相当于一般层析法中的固相容积, 它可以从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得; Vg 为凝胶本身的容积,Vt - Vo = Vi - Vg。“ 洗脱容积” ( Ve ) 是指自加入样品开始到组分最大浓度( 峰) 出现时所流出的容积, 它与Vo 及Vi 关系为: Ve = Vo - Kd Vi , 式中Kd 为样品在两相中的分配系数, 即分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数, 它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关, 而与柱形状无关, 对特定物质来说是一常数。对一层析柱凝胶床来说, 只要通过实验得知某一物质的洗脱容积Vo , 就可求出其Kd 值, 上式可以改写为Kd = ( Ve - Vo ) / Vi , 式中Vo 可用不被凝胶滞留的大分子物质溶液求得, 如蓝色葡聚糖-2000 ( MW =2000000 U) , 血红蛋白, 印度黑墨水等; Vi 可用g·Wr 求得( g为干凝胶重, Wr 为凝胶的吸水量, 以ml/ g 表示) 。
目前使用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶及琼脂糖和葡聚糖组成的复合凝胶。这些凝胶具有以下特点:化学性质稳定, 不与待分离物质发生反应, 没有或只有极少量的离子交换剂基团, 且有足够的机械强度。本实验用的是葡聚糖与还氧化氯丙烷通过交联反应制成的有孔颗粒状凝胶。交联程度越大孔径越小, 它不溶于有机溶剂, 能在水和电解质溶液中迅速溶涨。
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 缓缓搅拌Sephadex 悬浮液, 然后慢慢倒入预先置好的层析柱中, 使凝胶床达到2 . 5 cm×30 cm, 上端出口管用螺旋夹控制。千万不能产生气泡。当凝胶已完全沉降后, 控制凝胶床上面的液面在5 cm 左右。
【结果计算】 Kd 值的计算: 利用每管的光吸收值对管的编号数作图( 注意前7 管里以28 ml 一次收集的, 第一个4 ml 管的编号应为8 ) ,应在每个峰位置标出测量波长, 画一个坐标图, 用观察法或算术平均法确定每个峰的确切位置。算术平均法的计算式: 峰中点=峰内每管编号乘以峰内连续各管的光吸收值之和, 再除以峰内连续各管的光吸收值。 对1 ml 未知样品也按上述法做。计算出肌红蛋白的Kd 和未知样品的Kd 值。 肌红蛋白和未知样品分子量的估算: 利用下表数据, 用已知蛋白质的Kd 值(纵坐标) 对lgMW 作图, 再算出肌红蛋白和未知蛋白的分子量。 在图中适当位置标明肌红蛋白和未知样品的Kd 和MW。 展开 |
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