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研究揭示人胚胎发育转录组

2020.3.23

　　原始态（Naïve state）多能性相关研究是近年来干细胞及重编程领域的研究热点和难点，与传统的primed状态相比，Naïve态捕获了体内植入前胚胎发育的阶段，具有更强的可塑性，在早期胚胎发育研究及未来临床应用中具有更广阔的前景。在近10年的研究中，科学家们取得了一系列重要进展，已建立了较为稳定的人naïve 态多能干细胞的培养和诱导条件【1,2】，并通过抗体库筛选，发现了一系列能够用来分离、指征和鉴定naïve态多能干细胞及中间细胞群体的特定细胞表面蛋白【3】，为naïve态多能干细胞的纯化、分离以及naïve态诱导和培养体系的进一步优化提供重要基础。然而，目前所鉴定的表面抗原多在 naïve 态建立及维持过程中不发挥重要功能，而其在该过程中的动态及发生的分子机制也仍不清楚。

　　2020年3月17日，同济大学高绍荣教授团队在 Cell Reports发表题为 “Identification of ALPPL2 as a naïve pluripotent state-specific surface protein essential for human naïve pluripotency regulation”的研究论文，首次鉴定出特异指征人类naïve态多能性的功能性表面分子标志物ALPPL2蛋白，并揭示了其在人naïve态多能干细胞的建立和维持中的重要作用机制。

　　研究人员以系统比较人naïve态及primed态诱导多能干细胞的全部膜蛋白表达差异为基础，运用iTRAQ-MASS定量技术及组学分析技术，鉴定出naïve态多能性特异表面分子候选库。结合naïve／primed态胚胎干细胞膜蛋白的MASS定性分析结果，确定 ALPPL2蛋白作为研究重点。利用免疫荧光染色，研究人员分别检测培养在不同培养体系（5iLAF 或t2iLGÖ6983）下的naïve多能干细胞、人植入前早期胚胎及体细胞naïve重编程晚期细胞，进一步证实了ALPLL2的明显膜定位以及在naïve态细胞中的特异高表达。

　　同时，结合公共naïve／primed多能干细胞转录组数据、体细胞naïve／primed重编程转录组数据、人早期胚胎发育转录组数据，也发现ALPPL2特异地高表达于naïve态细胞中。从而在蛋白水平和转录组水平上分别验证了ALPPL2作为naïve态多能干细胞表面标志物分子的特异性和准确性。此外，在naïve态体细胞重编程、naïve-primed多能性状态转化等多种系统中，利用ALPPL2启动子驱动的报告系统可特异且准确地指征naïve态多能性的建立或退出，进一步验证了该分子对naïve态多能性特异的指征作用。

　　进一步的研究发现，利用CRISPR/Cas9系统敲除ALPPL2基因会导致naïve态多能性无法正常维持，具体表现为naïve态多能干细胞克隆的形态塌陷，报告系统荧光信号衰减以及naïve态多能性基因STAT3和TFCP2L1等显著下调；此外ALPPL2敲除的体细胞也不能正常的完成naïve态重编程，而对primed态细胞以及primed态重编程则没有明显影响，说明ALPPL2在naïve态多能干细胞的建立和维持中都发挥着重要作用。对此，研究者通过IP和co-IP蛋白互作实验发现了ALPPL2能够与IGF2BP1这一RNA结合蛋白发生紧密的相互作用，并且在naïve态细胞中敲除IGF2BP1的表型和转录谱都与ALPPL2 敲除十分相似，这些实验结果说明IGF2BP1可能是ALPPL2基因发挥作用的下游靶点。此前有研究结果表明IGF2BP1能够识别并结合某些特定的mRNA分子继而调节他们的稳定性和表达水平【4】。

　　紧接着，作者通过RNA免疫共沉淀技术（RIP）发现IGF2BP1能够特异识别并结合naïve态关键多能性因子STAT3和TFCP2L1 mRNA，稳定其表达。而外源过表达STAT3和TFCP2L1能够一定程度上的恢复ALPPL2或IGF2BP1敲除对naïve态多能干细胞的影响。研究人员还在敲除ALPPL2的naïve态细胞中分别过表达正常的IGF2BP1蛋白和点突变导致功能失活的IGF2BP1蛋白。实验结果发现，正常表达的IGF2BP1也能够一定程度上恢复ALPPL2敲除对naïve态多能干细胞的影响，而失活的IGF2BP1则对ALPPL2敲除后的细胞表型没有明显改变。

　　综上，这一研究鉴定了能特异性指征人类naïve态多能性的首个功能性表面分子标志物ALPPL2蛋白，并通过其功能机机制研究，深化了对naïve态多能性建立及维持的分子机制的理解，为naïve态建立过程中细胞命运决定机制及naïve态多能性诱导培养体系的优化等后续研究提供基础。

　　据悉，同济大学高绍荣课题组的直博生毕焱、涂志奋为本文章的共同第一作者；高绍荣教授、王译萱教授为本文的共同通讯作者。

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