化学发光免疫分析检测人血清中的癌胚抗原方法
由于癌胚抗原在结肠癌及胎儿的肠组织中被发现的，因而得名癌胚抗原。一般来说，癌胚抗原可作为结肠癌或直肠癌的特异性肿瘤标志物。在临床上，癌胚抗原已成为多种肿瘤检测的指标。癌胚抗原是一种糖蛋白，位于细胞表面，具有很强的特异性，常常在乳房，结肠等肿瘤中表达。癌胚抗原检测，可通过定量检测检测癌胚抗原在血清中的含量，可有效地诊断肿瘤，并对病变的范围进行评估，且可有效检测患者是否复发。化学发光测定技术具有很高的灵敏度，而免疫反应的特异性很高，二者相结合，便是新一代的化学发光免疫分析技术。这项免疫检测方法，是通过在抗体或抗原上，标记化学发光剂而形成的，包括2方面，化学发光及免疫化学反应。化学发光免疫分析技术，是一项新发展起来的免疫检测技术。相较之前的放射免疫分析技术，酶免疫分析技术，荧光免疫分析技术[1]，稳定性更强，灵敏度更高且操作更为便捷，优势明显，因而有替代前几项技术的趋势。为了探讨化学发光免疫分析检测人血清中的癌胚抗原方法，本文通过观察辣根过氧化物酶标记的癌胚抗原抗体的双抗夹心免疫反应，定量检测出人血清中的癌胚抗原含量。现分析如下。
1化学发光免疫分析
随着科技的发展，及多学科的不断交叉发展与研究，化学与医学也逐渐相结合，发展出了化学发光免疫分析技术。化学发光测定技术具有很高的灵敏度，而免疫反应的特异性很高，二者相结合，便是新一代的化学发光免疫分析技术。该项技术能够定量检测出目标物质含量，意义重大。辣根过氧化物酶是通常在该项技术中被采用，且临床检测中已经采用了辣根过氧化物酶的多个试剂盒[2]。相比于鲁米诺化学发光体系，就发光量子产率而言，过氧化草酸酯化学发光体系更高，就发光时间而言，后者有较长的成像时间，从而灵敏度更高。为构建电位免疫传感器，可使用辣根过氧化物酶作为电子供体，这是基于辣根过氧化物酶对3-（4-羟苯基） 丙酸（PHPPA） 与H2O2的催化作用。
2实验部分
2.1仪器与试剂：隔水式电热恒温培养箱（南京创睿仪器有限公司） ；HC-3018R 高速冷冻离心机（湖南湘立科学仪器有限公司） ； ACQ-600 超声波电源（佳姆信超声设备公司） ； XK96 型微量振荡器（常州诺基仪器有限公司） ；MPI-A 型多功能化学发光免疫分析仪（虫洞（北京）卫生科技有限公司）；精密pH 计（安徽赛科环保科技有限公司）。0.05 mol/L 3-（4-羟苯基） 丙酸（PHPPA，山东隆邦化工有限公司） 缓冲溶液；乙腈（淄博百运化工有限公司） ；5.0 mmol/L TCPO（自制） 的乙腈溶液； 1.0 mol/L H2O2-乙腈溶液；CEA 诊断试剂盒（天津洁瑞医学生物工程有限公司） ； 0.05 mol/L H2O2缓冲溶液；HCl， 1.0 mmol/L 咪唑（湖北兴银河化工有限公司） 乙腈溶液；H3BO3，NaOH，NaH2PO4， Na2CO3，NaHCO3， Na2HPO4， Na2B4O7，H2O2，CH3COONa，三羟甲基氨基甲烷（Tris），柠檬酸均购自加力安生物科技公司。用pH 6.0 磷酸盐缓冲溶液将PHPPA和H2O2水溶液稀释至所需浓度；在使用TCPO 和H2O2的乙腈溶液时，可根据需要，使用同样的溶剂稀释。以上所有水都是蒸馏制得，均为离子交换水[3]。
2.2预处理人血清样品：将人体静脉血液用作人血清样品，样品血液一定要新鲜，并使用无菌塑料进行包装，同时，不得加入任何物质，在室温条件下，使之沉降30分钟，然后对其进行离心处理，不低于10分钟，速率以3000 r/min 为宜。最后，用样品收集器将上层血清进行收集，而后将之储存在4 ℃冰箱中备用。
2.3免疫分析：采用，将待测癌胚抗原加入到已包被在有CEA 单克隆抗体的96 孔反应板中，加入需要检测的癌胚抗原，分析方法采用双抗体夹心免疫分析法。将抗癌胚抗原单克隆抗体用辣根过氧化物酶进行标记之前，要进行孵育和洗涤，而后经过再次的孵育和洗涤，然后将其拍干，再加入PHPPA溶液 以及H2O2溶液，通过振荡，使其混合均匀，时间不低于1分钟，接着在37℃ 温度中，保持10分钟。在这时，辣根过氧化物酶可催化H2O2将PHPPA氧化，而后 PHPPA 的二聚体可生成，而该二聚体可发出荧光。从不同的反应孔中取出50 uL 反应后的溶液，使用微量加样器，将之置于另外一个96 孔的反应板中，同时要加入H2O2（含咪唑），而后将之置于发光检测器，并加入TCPO乙腈溶液，化学发光信号在此之后的8s可以开始进行记录[4]。
3结果
由于H2O2将PHPPA氧化，而后生成PHPPA 的二聚体，从而可产生荧光。产生荧光的物质为3-（4-羟苯基） 丙酸二聚体，而后，可形成活性中间体，该中间体具有高能量，是由H2O2对TCPO的氧化产物。荧光物质可从活性中间体中，获得能量，从而被激发。而化学发光是在荧光物质从激发态转化为基态的时候而产生的。该过程为定量检测，并和化学发光反应及酶催化反应相关。通过观察，我们发现，，在实验中，溶液条件，以及H2O2，TCPO，PHPPA和咪唑的浓度等因素被优化。在辣根过氧化物酶的反应中，荧光物质的生成会受到缓冲溶液的pH 值影响，而磷酸盐缓冲溶液可为辣根过氧化物酶的催化反应提供最好的稳定性，且发光最强时，pH值为6.0。其次，温度也会影响辣根过氧化物酶的生物活性，若温度过高或过低，都会降低荧光物质的浓度，因而降低发光强度。同时，孵育时间也会影响发光强度，若时间过长，发光强度增速变缓。最佳的孵育时间为10分钟。对发光信噪比而言，PHPPA和H2O2浓度可对其产生影响。结果显示，发光信噪比最大时，PHPPA 的浓度为5.0 mmol/L，当其浓度低于5.0 mmol/L时，发光强度可降低。由于 TCPO 不易溶于水，因此，水相环境会降低其化学发光强度。
4结论
癌胚抗原检测，作为临床的常规检测项目，可通过定量检测检测癌胚抗原在血清中的含量，可有效地诊断肿瘤，并对病变的范围进行评估，且可有效检测患者是否复发。化学发光免疫分析进行的检测，可定性也可定量，且测定结果准确，在临床上检测上，使用也越来越广泛。。辣根过氧化物酶是通常在该项技术中被采用，且临床检测中已经采用了辣根过氧化物酶的多个试剂盒。在实验中，溶液条件，以及H2O2，TCPO，PHPPA和咪唑的浓度等因素被优化。在辣根过氧化物酶的反应中， 6.0的ph值，磷酸盐缓冲溶液，10分钟的孵育时间，适宜的温度，非水相环境等，以上条件都会使发光强度最大化。
-
综述
-
科技前沿
-
技术原理
-
综述
-
技术原理
-
焦点事件
-
综述
-
项目成果
-
焦点事件
-
焦点事件
-
焦点事件
-
焦点事件
-
企业风采
-
焦点事件
