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通过高内涵分析软件进行人体干细胞诱导神经元细胞系...

2020.4.21

通过高内涵分析软件进行人体干细胞诱导神经元细胞系的3D模型表征分析

简介

开发更复杂的、生物相关的和预测的基于细胞的化合物筛选方法是药物发现中的一个主要挑战。三维 (3D) 分析模型的开发和集成正变得越来越流行，并驱动着生物转化学的发展。具体而言，3D 培养物具有精致浓缩了人体组织各方面特征的优点，包括结构、细胞组织、细胞-细胞和细胞-基质相互作用，以及更多生理相关的特征延伸。

水凝胶广泛用于模拟在 3D 环境中生长的神经细胞的细胞外基质。水凝胶是聚 ( 乙二醇 ) (PEG) 为基础，完全合成的，全透明的物质。水凝胶通过掺入 MMP 切割位点来帮助细胞迁移，并包含 RGD 细胞粘连基序以支撑细胞的粘附作用。完全合成的水凝胶是预先铺展在 96 孔板中，其特征在于深层次的密度梯度促进细胞在水凝胶表面上进行三维渗透 ( 3D ProSeedTM 水凝胶，ECICA 技术 )。这种水凝胶预制板使用方法简便，同时能很好的兼容自动化设备 ( 图 1 )。

同时，人类诱导的多能干细胞 (iPSC) 衍生的神经元也越来越多地用于生理细胞模型的开发;与用于神经科学应用的原代细胞和动物模型相比，它们的人类起源，更长久的再生能力和无限量的可用性使它们在神经系统科学应用中独具优势。

在多孔板中形成 3D 神经元网络

我们优化了 96 孔板的细胞培养和染色，并发展了完善的共聚焦成像及分析方法，让神经元以 3D 模型的形式进行形态表型和生存能力的测量用于测定的细胞是 CN.4UTM (Axiogen AG)，是由神经元 ( 谷氨酸能、多巴胺能和 GABAergic ) 和星形胶质细胞组成的人 iPSC 诱导细胞混合体。CNS.4UTM 细胞在 3D ProSeedTM 水凝胶 (Ectica Technologies) 中孵育 14 天。细胞以 40000 个神经元每孔的密度培养在 200 μl 培养基中。对于选定的研究，也评估了细胞接种密度的影响 ( 5000 ～ 8000 个细胞/孔 )。培养基的组成包括 50:50 混合神经基础培养基 + DMEM / F12 + 补充剂 (Axiogenesis)。

细胞接种在水凝胶的表面，然后渗透到水凝胶内部 ( 图1 )。神经突起生长开始于种植后 24 h，接着连续培养 14 天以上。通过透射光成像监测神经网络的形成过程。对于端点测量，使用 4% 甲醛固定细胞，然后用 0.1% 的 Triton X-100 通透，并用荧光抗体结合抗体对 TUJ-1 神经元标记物染色，加上 Hoechst 核染色。

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周锦帆