AB Sciex视频讲座“AB Sciex 电喷雾质谱在蛋白质组学中的应用”

2011-4-14 10:25 来源: 分析测试百科网
收藏到BLOG

  4月12日,AB Sciex 公司在分析测试百科网成功举办了题为“AB Sciex 电喷雾质谱在蛋白质组学中的应用”的网络视频讲座。AB Sciex 亚太应用支持中心的靳文海博士首先为大家简单介绍了蛋白质组学和质谱技术发展方向,接下来重点讲解了AB SCIEX Triple TOF 5600在发现蛋白质组学中的应用以及AB SCIEX QTRAP 5500在生物标志物研究中的应用。

  蛋白质组学和质谱技术发展方向

  蛋白质组学是非常庞大的一门学科,从2000年蓬勃发展到现在,研究的热点已经从鉴定蛋白质转移到蛋白质的定量。目前,面对的挑战主要集中在四个方面:高动态范围、复杂的翻译后修饰、很难获得低丰度蛋白质和无法准确测定完整的蛋白质组等。

  蛋白质组学研究中质谱涉及的领域有:一是蛋白质鉴定(也包括发现蛋白质间的一些差异,进行初定量和半定量)主要依赖于质谱的灵敏度和分辨率,另一个是对蛋白质或肽段进行真正意义上的和功能相关的相对或绝对定量,这也是目前蛋白质组学研究的热点,目标是要做到精确和实时定量。基于以上两点,对质谱提出了明确要求,就是定性和定量的完美结合,但目前绝大多数质谱都是只能做定性或只能做定量。其中,定量分析中的线性动态范围也是质谱的一个永恒追求。

  AB SCIEX去年推出的 Triple TOFTM 5600质谱系统能同时满足蛋白质组学研究中定性和定量的要求。随后,靳博士为大家详细的讲解了AB SCIEX Triple TOFTM 5600在发现蛋白质组学中的应用。

  AB SCIEX  Triple TOF™ 5600在发现蛋白质组学中的应用

  AB SCIEX  Triple TOF™ 系统是目前为止最快,最灵敏的高分辨质谱,能够充分满足高标准的定性和定量分析的需要。

  Triple TOF™ 5600质谱系统

  在一个平台上同时涵盖蛋白质组学的定性和定量研究,主要特点:

  (1)高灵敏度。在全扫描和二级质谱扫描方式,灵敏度达到业界高端QQQ质谱的MRM水平,使得更多低丰度的蛋白质能被检测和鉴定到;

  (2)SmartSpeed™ 100Hz采集速率。

   定性:单位时间内,相比任何质谱,中性丢失触发 IDA扫描等方式的更多时间用在MS/MS上,保证质谱对复杂样品的挖掘深度,提高对复杂样品检测的实际灵敏度,从而鉴定到更多的蛋白质;

   定量:不论MS或是MS/MS,都能获得更多的数据点,使得定量数据更可靠;

  (3)高分辨率。在MS和MS/MS,低分子量区和高分子量区,低扫描速度和高扫描速度下,都能达到高分辨率,满足蛋白质组学中对分辨率的绝大多数要求,对从头测序、iTRAQ提供最好的支持;

  (4)EasyMass™ 质量准确度,质量准确度小于1ppm(RMS),MS和MS/MS都能达到,从而提供最可信的蛋白质鉴定数据;

  (5)线性动态范围,真正的大于4个数量级,是所有高分辨质谱中定量能力最强的;

  (6)可靠性,执行严格的工业可靠性标准,系统采用创新的磁悬浮分子涡轮泵,基本无机械损耗,低噪音。

  Triple TOFTM 5600上具有未知物筛查(Explore)、多目标物同时定量/定性(Profile)以及定量分析(Quantify)这三个工作模式。靳博士各用一个实例展示了Triple TOFTM 5600在蛋白质组学上的应用。分别是:在蛋白质和肽段鉴定方面,采用Explore模式进行酵母细胞裂解物的胰酶消化产物的分析实验;Profile模式下进行磷酸化肽段分析实验,实现一次实验同时定性定量等。

  AB SCIEX QTRAP 5500在生物标志物研究中的应用

  生物标志物的研究分为发现、验证和确认。生物标志物“发现”的核心是发现差异,这些差异包括表达数量、表达位置和修饰状态方面的差异。发现这些差异有助于发现疾病相关的特异性蛋白质,作为临床诊断的分子标记或者作为治疗和药物开发的靶点。最常见的差异是表达量的差异即蛋白质的差异表达。生物标志物“验证”的核心是“去除前期发现的假阳性”。

  发现阶段得到的蛋白质差异表达结果需要质谱进一步验证才能够被确认,发现阶段和验证阶段所用的质谱种类不同,工作原理不同;验证阶段所用的工作模式,已被小分子特别是药物研发领域誉为黄金标准,技术成熟。

  AB SCIEX公司推荐给用户采用Qtrap质谱系统进行生物标志物的验证研究。AB SCIEX公司用于蛋白质组学分析的Qtrap质谱系统包括3200 QTRAP、4000 QTRAP和5500 QTRAP这三款产品。今天,靳博士主要给大家介绍了5500 QTRAP。

  5500 QTRAP四极杆-线性阱杂交质谱仪

  QTRAP质谱系统是一种杂合的质谱仪,将三重四级杆和线性离子阱组合型系统,三重四级杆的Q3能在1ms内实现QQQ和QqLIT两种模式的转换,避开了单独QQQ和单独LIT的缺点,结合了两者的优点。

  串联四极杆-­线性离子阱技术

   QTRAP质谱系统具备特有的MIDAS工作流程,该技术结合了Qtrap质谱仪串联四极杆的高选择性的MRM扫描和线性离子阱高灵敏度的MS/MS扫描功能。软件能够自动构成MRM离子对,MRM采集后,便迅速在离子阱内进行MS/MS全扫描。由于QTRAP质谱系统的第三个四极杆能够在1ms的情况下切换成线性离子阱,使得MS/MS扫描灵敏度提高500倍左右,有效去除假阳性。

  在肽段MRM定量方面AB有一款非常好的软件—MRMPilot软件,能够自动、方便、直观的建立MIDAS工作流程。在定量方法的建立和优化时,MRMPilot能自动生成质谱采集方法,将采集到得数据导入回软件,进行MS分析。不仅大大提高了工作效率,更重要的是避免了整个定量数据假阳性的可能。

   采用MRM进行蛋白质定量的另一个重要的环节就是需要有内标,因此AB公司推出了一款mTRAQ™试剂,它是一种定量的内标,实现归一化,提高定量实验的重复性和一致性。其特点为:是一种非同重同位素标签,基于iTRAQ™试剂发展而来(iTRAQ试剂是同重标签),标记原理、方法和效率相同,实现了生物标志物发现和验证两个阶段的无缝链接。.在MS或MS/MS,轻、重标记都有4amu的质量差异,这一点与iTRAQ试剂不同。也可以针对高质量碎片离子设计特定的MRM离子对:提高了特异性、降低了噪音(LC/MS的高质量端噪音较低)。 MRM的轻、重标记的离子对在Q1和Q3的质量数都是不同的。轻、重标记的肽段在色谱上表现为共洗脱。

  最后,靳博士简单的介绍了AB SCIEX公司位于上海的亚太技术应用支持中心(ASC),ASC 致力于为生命科学领域的研究者和AB的客户提供快捷、全方位的一站式服务。


  相关产品:QTRAP 5500 四极杆-线性阱复合型质谱仪

             TripleTOF™ 5600质谱系统


  问题与答案:

  1、目前采用MRM做肽段和蛋白质定量的时候,发表的文献里面采用QTRAP的比例高吗:

   答:对于整个肽段MRM定量,从全球来讲,是07年底到08年初才开始出现的方向,到目前有三年的时间,就个人感觉,最保守的估计有70%的文章采用的是AB的4000 QTRAP或5500 QTRAP 进行肽段MRM定量研究。

   2、直接使用QTRAP 5500能不能进行发现蛋白质组学的研究,在这方面5500和MALDI TOF-TOF 5800系统有什么区别?

  答:QTRAP 5500 有离子阱的一部分功能,可以做蛋白质的鉴定,在发现蛋白质组学的研究方面QTRAP 5500要比MALDI TOF-TOF 5800差一些。QTRAP 5500主要是在对肽段定量方面去除前期发现的假阳性具有优势。

  3、5600是不是包含了5500的所有功能呢?

  答:两者都可以进行定量和定性研究。5600是Triple TOF,是高分辨率类型,在蛋白质定性和差异性表达能力更加突出;5500是QTRAP,既有三重四极杆又有线性离子阱的功能,在肽段定量和MRM定量方面更加突出。

  4、MRM-IDA-EPI会不会影响扫描的灵敏度和准确性呢?

  答:MRM-IDA-EPI是在普通的MRM扫描后加了EPI。整个时间和单纯MRM相比,也就延长了大概十几个毫秒左右,MRM的数目减少的非常少。但是可以利用EPI去除假阳性,相对于带来的好处,速度的轻微减少可以忽略不计。

  5、5600在做蛋白质翻译后修饰方面优势在哪里?

  答:5600的最大的特点是扫描速度非常快,灵敏度非常高,在复杂混合物中低丰度的磷酸化肽段的鉴定方面很有优势。而且能在一张图谱上实现糖链结构和糖肽骨架结构同时分期。再加上5600的高分辨是不牺牲扫描速度的,在这个情况下,对于样本的翻译后修饰的鉴定,不论是磷酸化、糖基化还是其他翻译后修饰甲基化等,性能都是突出的。

  6、在蛋白差异方面研究中,两种不同地域样本的比较,什么样的仪器方案更合适呢?

  答:在差异表达研究方面,推荐个大家的还是Triple TOFTM 5600,iTRAQ 流程这个组合,因为在AB用户中使用iTRAQ流程做这方面的研究还是比较成功的。使用这个工作流程,一次实验最多能实现8组样本的比较,所有处理和生物信息学分析都能提供自动化的软件支持。

  更多问题网友可以通过邮箱和靳老师联系,靳老师邮箱:kerong.zhang@absciex.com

  本次讲座的PPT录音文件参见网址:http://www.antpedia.com/corp/data-987.html