血液涂片的制作与染色
做好血液涂片和正确染色是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节。
一．玻片的清洁
1．一般清洗法
（1） 将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。
（2） 用热水将肥皂和血膜等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 ～5 次。必要时再置95%乙醇中浸泡1小时，然后擦干或烘干备用。 新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或10 %盐酸浸泡24小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。
2．油污载片清洗法
（1） 清洗液
甲液：10g/L的过锰酸钾水溶液，乙液：25g/L的草酸水溶液。
（2） 清洗方法：将用过的玻片投入甲液数小时，取出后再投入乙液数小时，然后用自来水和蒸馏水冲洗干净后再置95%乙醇中，以毛巾擦干净即成。久用后甲液可出现泥沙样沉淀，乙液有乳白色沉淀，可用棉花滤去再用，如乙液褪色应重新配置。
二．血涂片制作
取末梢血1滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载片保持30
～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。血膜干燥后，用铅笔在血膜的一侧写上病人姓名或编号。
一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。
涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。太薄的血膜片50%的白细胞集中于边缘或尾部，不利于白细胞分类。如果血膜分布不匀，主要是推片不整齐，用力不均匀，载片不清洁所致。
三．染色
1．瑞氏染色法 （Wright staining）
本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞中 的特异性颗粒着色较好，但对核的着色较差。
（1） 原理 瑞氏染粉是由伊红和美蓝混合后组成的一种中性盐染料。伊红是一种酸性染料，为伊红钠盐，其有色部分为阴离子；美蓝是一种碱性染料，为氯化美蓝，有色基团为阳离 子。如以M+代表美蓝，以E-代表伊红，其反应式为：
M+Cl- +Na+E→ ME↓+NaCl
美蓝 伊红 伊红化美蓝（瑞士染料）
将适量的ME溶解在甲醇中，即成为瑞氏染液。甲醇的作用可使ME溶解，解离为M+和E－，这两种有色离子可以选择性地吸附血细胞内的不同成分而着色。甲醇的另一个作用是有很强的脱水作用，可将细胞固定为一定形态，当细胞发生凝固时，蛋白质被沉淀为颗粒状或者网状结构，增加细胞结构的表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。
细胞的着色过程是染料透入被染物并存留其内部的一种过程，此过程既有物理吸附作用，又有化学亲和作用。各种细胞及细胞的各种成分由于其化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样，因此，在血片上可以见到不同的着色。细胞中碱性物质与酸性染料伊红结合染成红色，因此该物质又称为嗜酸性物质。如，红细胞中的血红蛋白，嗜酸
性粒细胞胞浆中的颗粒为碱性物质，这些物质可与伊红结合染成红色。细胞中的酸性物质可与染液中的碱性染料美蓝结合染成蓝色，该物质又称嗜碱性物质，如：嗜碱性粒细胞中的颗粒为酸性物质可与碱性染料美蓝结合染成蓝色。细胞核主要由脱氧核糖核酸和
强碱性的组蛋白、精蛋白等形式的核蛋白所组成，这种强碱性的物质与瑞氏染液中的酸
性染料伊红结合成红色，但因为核蛋白中还有少量的弱酸性物质，它们又与染料中的碱
性染料美蓝作用染成蓝色。但因含量太少，蓝色反应极弱，故核染色呈现紫红色。幼稚
红细胞的胞浆和细胞核的核仁中含有酸性物质，它们与染液中的碱性染料美蓝有亲和
力，故染成蓝色。当细胞含酸、碱性物质各半时，它们既与酸性染料作用，又与碱性染
料作用，染成红蓝色或灰红色，即所谓多嗜性。当胞浆中的酸性物质消失时，只与染液 中的伊红起作用，则染成红色，即所谓正色性。
（2） 试剂
①.瑞氏染液
瑞氏染料 （粉） 1．0g
纯甲醇 （AR 级以上） 600．0 ml
将全部染料放入乳钵内，先加少量甲醇慢慢地研磨 （至少半小时），以使染料充分 溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒人洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶 解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。 密闭保存。
②.磷酸盐缓冲液 （pH6．4 ～6．8）
磷酸二氢钾 （KH2PO4） 0．3g
磷酸氢二钠 （Na2 HPO4） 0．2g
蒸馏水 加至1000．0ml
配好后用磷酸盐溶液校正pH ，如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。
（3） 操作
①用蜡笔在血膜两头划线，以防染液溢出，然后将血膜平放在染色架上。
②用瑞氏染液3 ～5滴覆盖整个血膜，固定细胞0．5 ～1分钟。
③滴加等量或稍多的缓冲液，用吸球将其与染液吹匀，或者摇动玻片染色5 ～10分钟。
④慢慢摇动玻片，然后用流动水从玻片的一侧冲去染液，待血片自然干燥后 （或用滤纸吸干），即可镜检。
2．姬姆萨染色法 （Giemsa staining）
（1）原理 姬姆萨染料由天青、伊红组成，其染色原理与瑞氏染色法基本相同，但姬姆萨染色
法对细胞核着色较好，结构显示更清晰，而对胞浆和中性颗粒则染色较差。
（2）试剂
姬姆萨 （Giemsa） 染料 1．0g 甘油 66．0ml 甲醇 66．0ml
将1．0g
姬姆萨染料粉末全部倒入盛有66．0ml 甘油的圆锥烧瓶内，在56 ℃的水浴锅 上加热90 ～120
分钟，使染料与甘油充分混匀溶解，然后加入60 ℃预热的甲醇，充分摇 匀后置棕色瓶中，于室温下7
天，过滤后才能使用。此种染液放置时间愈久，细胞着色 越佳。
（3）操作
①.将干燥血片用甲醇固定3 ～5 分钟。
②.将固定的血片置于被pH6．4 ～6．8 磷酸盐缓冲液 （同瑞氏染色） 稀释10 ～20 倍的 姬姆萨染液中，浸染10 ～30 分钟 （标本较少可用滴染法）。
③.取出用水冲洗，待干后镜检。
3．瑞氏姬姆萨混合一次染色法
I 液：取瑞氏染粉1g 、姬姆萨染粉0．3g，置洁净研钵中，加少量甲醇（分析纯） 研 磨片刻，吸出上层染液。再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上液。如此连续几次，共用 甲醇500ml，收集于棕色瓶中，每天早、晚各振摇3分钟，共5天，以后存放1周即能使用。
Ⅱ液：pH6．4 ～6．8 磷酸盐缓冲液
磷酸二氢钾 （无水） 6．64g 磷酸氢二钾 （无水） 2．56g 加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH ，加水至1000ml。
操作 平置玻片于染色架上，滴加染液3 ～5 滴，使其迅速盖满血膜，约1 分钟后， 滴加缓冲液5 ～10 滴，轻轻摇动玻片或对准血片吹气，与染液充分混合，5 ～10分钟后 用水冲去染液，待干。
四．血涂片的质量控制
1．血膜片的质量要求是厚薄均匀适度，低倍镜下观察全片，细胞不重叠，头尾及 两侧有一定的空隙，血膜头部有明确的病人标志。
2．些体积较大的特殊细胞常在血膜的尾部出现，因此蜡笔划线时应注意保存血膜 尾部细胞，血膜必须充分干燥，否则在染色过程中容易脱落。
3．配制染料须用优质甲醇，稀释染液用缓冲液，因为缓冲液的pH
对细胞染色的影响很重要。在偏酸性环境中正电荷增多，在偏碱性环境中负电荷增多，又因为细胞着色
对氢离子浓度十分敏感。如果染色偏碱，原是紫红色的中性颗粒则染成深蓝色，造成识 别困难。冲洗须用中性水，虽亦可用自来水 （但不能保持稳定）。
4．对所用染液应进行预染试验，新配制的染液放置一段时间后其中的美蓝逐渐氧
化成天青B ，天青B 对细胞核的着色效果比美蓝好，因此，瑞氏染液放置时间越长染色
效果越好，临床上称之为成熟。判断染液成熟程度的简易方法是用正常优质血片做预染
试验，先用低倍镜观察载有染液的血片，认为着色满意后，再按照染色后冲洗顺序最后
用油镜镜检，这样不仅可了解染液的成熟程度，而且还可以选择合适的染色时间，供临 床标本染色时参考。
5．染液与缓冲液的比例要适当，以1∶27
为宜。一般说来缓冲液稀释度愈大，染色 时间愈长，细胞着色愈匀称、鲜艳。缓冲液和染液量要充足，否则染液很快蒸发，染料
沉淀于细胞上，使细胞深染而无法检查。细胞较多较厚的涂片 （如红细胞增多症） 染液 应多些。细胞较少的涂片染液应少些。
6．染色时间与染液浓度、室温高低、细胞多少有关，染液愈淡，室温越低，细胞 愈多，所需时间越长，应适当增加染液浓度，因此必须根据情况灵活掌握。
7．染色良好的血膜片，外观呈浅红色，红细胞呈粉红色，白细胞核呈暗紫红色， 染色质结构能辨，粒细胞的颗粒呈固有种异颜色。
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