人脐带静脉内皮细胞的分离培养与增殖试验
血管内皮细胞不仅参与调节血管通透性和凝血过程，在免疫调节，移植排斥，肿瘤转移，炎症等许多过程中也具有重要作用。内皮细胞培养是体外研究内皮细胞功能的重要手段。70年代Eric等建立了内皮细胞分离及体外培养的方法。人脐带静脉是人血管内皮细胞最易获取的来源，在人内皮细胞的研究中被普遍采用。
㈠ 原理在体外，内皮细胞在内皮细胞生长因子存在的条件下可迅速增殖，并可传代，可作为内皮细胞增殖，细胞因子分泌、表型等研究的模型。
㈡ 方法
1. 脐带内皮细胞的分离
试剂与器材
⑴ 胶原酶(Sigma)：I型((C-0130),用无血清RPMI 1640配成0.1％(W/V),分装、-20℃保存。
⑵ Cord Buffor：
NaCl 0.14M 8.182克
KCl 0.004M 0.298克
glucose 0.01M 2.180克
NaHPO４.12H2O 0.030克
0.001M
Na2HPO４·12H2O 0.290克
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加三蒸水至1000ml
配好后8磅、20min高压灭菌
⑶ 脐带静脉插管：取16号针头去掉尾部及头部斜面，用砂纸磨平，全部套入输液用硅胶管，硅胶管另一端再接另一个16号针头。
⑷ 止血钳4把、30ml、10ml注射器，无菌手套、粗丝线、饭盒等。
操作步骤：
⑴ 脐带收集：用无菌止血钳夹闭脐带两端，在止血钳外侧剪断脐带，放入盛有4℃Cord Buffer的饭盒内。脐带在4℃放置不应超过24小时。
⑵ 脐带内皮细胞分离
带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，
用无菌剪刀将两端脐带剪除。
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在脐带一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用2根粗丝线扎牢，
用Cord Buffer抽吸有的30ml注射器冲洗静脉腔，至将脐血洗净。
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赶出静脉腔内残余液体，将脐带另一端用止血钳夹闭，用10ml注射器
连接针头，注入37℃预热的0.1％胶原酶约6-8ml，放入37℃
Cord Buffer中保温6-10min
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吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20mlcord
Buffer的离心管中，冲洗静脉腔，一并加入离心管中。
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离心，1500rpm,10min
弃上清，用5～7ml 20％FCS，RPMT 1640重悬细胞，转入培养瓶，
放5％CO孵箱
2. 牛下丘脑内皮细胞生长因子粗提物的制备
试剂和器材：
生埋盐水，硫酸链霉素，组织匀浆机，高速冷冻离心机，振荡器等。
操作步骤：
取新鲜牛下丘脑，加1.5倍体积的冰生理盐水
用组织匀浆机匀浆，每次0.5min,共6次
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在4℃条件下用震荡器机械震荡约1.5h。
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离心，10000g,40min，收取上清液，
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按0.5％加硫酸链霉素，4℃过夜
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离心，20000g,40min，收取上清液，
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用紫外分光光度测280nm，260nm OD值按公式计算蛋白含量
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过滤、分装、-20℃保存备用
3. 内皮细胞的培养与鉴定
试剂与器材
⑴ 0.1％胰酶0.02％EDTA-Na：称取胰酶及EDTA-Na,用无血清RPMI1640配成溶液,胰酶浓度为1％，EDTA-Na浓度为0.2％。过滤，分装，-20℃保存。用前用无血清RPMI1640稀释10倍。
⑵ 0.2％明胶：称取明胶，用三蒸水配成0.2％(W/V)溶液，37℃水浴溶解，过滤，放4℃备用。
⑶ 199培养基(按说明配制)，小牛血清。内皮细胞生长因子粗提物，肝素，第Ⅷ因子抗体，培养瓶，CO孵箱，倒置显微镜，超净工作台等。
操作步骤：
⑴ 培养瓶包被明胶：培养瓶(25cm)中加入0.2％明胶3ml，使其铺满瓶底，放4℃备用。用前弃去明胶溶液。
⑵ 原代培养：将从脐带静脉中收集到的内皮细胞移入包被明胶的培养瓶(25cm)，加5～7ml 20％小牛血清199培养基，牪"按终浓度分别为20μg/ml和100μg/ml加入内皮细胞生长因子粗提物和肝素。每3～4天换液1次。
⑶ 传代培养：待内皮细胞生长铺满瓶底后即可传代。吸去培养基,用无血清RPMI1640 2ml洗培养瓶1次。加入0.1％胰酶、0.02％EDTA-Na3ml，放37℃孵箱。待镜下见大多数细胞卷缩变圆，可加入含血清培养基3ml，以终止胰酶的消化作用，用弯头滴管吹打。收取细胞悬液,加入离心管中,离心1500rpm，10min。弃上清，以完全培养基重悬细胞，移入培养瓶扩大培养。
⑷ 内皮细胞鉴定：光镜下内皮细胞为多角形或梭形，可见1～2个清晰的细胞核。透射电镜下, 部分内皮细胞中可有特征性的Weible-Palade小体存在。间接免疫荧光染色,内皮细胞为ⅧR∶Ag阳性。
⑷ 牛下丘脑内皮细胞生长因子粗提物活性的测定
试剂与器材：
96孔板。余同内皮细胞培养。
操作步骤：
0.1％胰酶0.02％EDTA消化收获内皮细胞，计数，调整细胞
数至5×10４/ml,
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细胞悬液加入包被明胶的96孔板，每孔100μl，5×10３个细胞。
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放置于5％CO孵箱，24h，待细胞全部贴壁生长
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每孔加待检样品100μl，每个稀释度设3个复孔，并设
培养基阴性对照
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放5％CO孵育，48～72h，待阴性对照与阳性有
明显差别时，加３HTdR，每孔0.5μci/50μl
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放5％CO孵箱，继续培养12h
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细胞收集仪收集细胞，检测Cpm值可计算刺激指数
㈢ 注意事项：
1. 严格无菌操作，防止在分离、培养和传代内皮细胞过程中发生污染。
2. 胶原酶消化时所需浓度，时向要进行预试。如胶原酶浓度过高，内皮细胞容易死亡；浓度过低，则细胞收获量低。
3. 内皮细胞应进行鉴定，以防将成纤维细胞误认为内皮细胞。
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