Molecular Devices使用多能诱导干细胞(iPSC)来源的肝...（二）
“Find Spherical Objects”功能还可用于识别单个细胞和细胞核或利用适当的特征将不同的单细胞区别开来。此外，3D分析模块可以按照用户自定义选项“Connect by BestMatch”, “Connect byTouching”, 和 “Do NotConnect Objects”将不同层面的目标结构连接起来。
首先对Z轴层扫中的每层图片按照2D图片进行分割、分析并得到细胞核个数，细胞死/活和细胞分类等参数的测量值；其次利用用户定义的目标结构的最大范围将其连接起来。如：
细胞核最大范围 3-6 μm
细胞质最大范围 20-30 μm
最终，在3D结构中将细胞核或单细胞分割出来。整个过程中目标结构不会丢失也不会被重复计数。所有的细胞（如：calceinAM 阳性/阴性细胞；Ethidium homodimer阳性/阴性细胞）都会被识别、被计数。
为了直观表现目标结构的整体/平均荧光强度、体积、直径、间距以及目标结构在三维空间中的定位等参数，可用不同颜色标记单个细胞。利用细胞球标记范围（ spheroid masking ）对更小的结构进行计数，这些结构可能在标记范围（mask）之中或在标记范围（mask）之外。如：对每孔只含有一个细胞球的样品进行分析时，利用单细胞标记（ single-cell masking ）可以对所有细胞进行计数并将位于细胞球中和细胞球外的细胞区别开来。当细胞球不完整时，这种图形处理方式就显得十分重要。对每孔含有多个细胞球的样品（细胞球与基质共培养）进行分析时，这种图形处理方式可以定义每个细胞球的容量并得出均值。
图 4A 显示了不同层面的2D图像中 calceinAM 阳性细胞的细胞分类结果。利用“Connect by Best Match” 功能可以将细胞在3D空间中连接起来。相同的方法可以分析 ethidium homodimer 阳性/阴性细胞(细胞死/活分析) 也可以分析线粒体、荧光强度、细胞凋亡还可以分析特定染料和标记物。
使用多参数表型筛选结果进行毒性评价
利用多种肝毒素处理细胞球，观察细胞球表型和细胞含量的显著变化。许多细胞球失去了球状结构，球体发生崩解，细胞球变得松散、扁平、不规则。细胞从主体结构中脱离，或出现凝结核，表明细胞已经死亡。 当化合物浓度超过一定范围，细胞表型就会出现上述变化 (图4B)。 利用图像量化分析得到的参数对细胞球的形态特征、细胞含量和结构复杂程度进行评估。检测细胞球体积、直径、荧光强度，同时检测calcein AM 阳性细胞(活细胞)、EthD-1 阳性细胞（死细胞）个数。细胞球经化合物处理后，细胞总数没有变化，死细胞数量上升，活细胞数量下降（具有浓度依赖特性）；细胞球和单个细胞（细胞质）中calcein AM的平均荧光强度显著降低。
为进一步研究细胞毒性机制，我们对细胞的凋亡特征和线粒体完整性进行评估。化合物处理细胞球24小时后用caspase 3/7 荧光染料检测细胞凋亡的活化程度。 caspase 3/7 对细胞球（经甲基汞处理的对照组细胞球）的染色结果如图2B所示。用化合物处理细胞球后会诱导细胞凋亡，导致 caspase 3/7 荧光强度增加，caspase 3/7 阳性细胞（凋亡细胞）的个数增加。 用MitoTracker Orange 荧光染料染色结果来反映线粒体膜电位的变化情况。用化合物处理细胞球后会破坏线粒体结构的完整，进而导致MitoTracker Orange荧光强度降低（具有浓度依赖特性，图2C ）
对活细胞个数、 calcein AM 荧光强度、 calceinAM 阳性细胞含量等参数进行测量后发现这些参数都完美的符合四参数剂量反应曲线模型(图 4B)。IC50 值 (表 2) 由SoftMax® Pro 6 软件(MolecularDevices)生成。
总结：
在对肝毒性进行评价的过程中，3D肝脏球模型+高内涵3D分析模式作为一种反应灵敏、可重复性高的方法，越来越展现出广阔的应用前景。该方法预测准确率相比于动物实验和临床数据仍需要继续完善。相关模型的进一步发展，检测方法的进一步优化有利于拓展该方法在体外筛选领域中的应用空间。
参考文献：
Chang, T. T., & Hughes-Fulford, M. (2009).Monolayer and Spheroid Culture of Human Liver Hepatocellular Carcinoma Cell Line Cells Demonstrate Distinct Global Gene Expression Patterns and Functional Phenotypes. Tissue Engineering Part A, 15(3), 559-567.
Hartung, T. (2009). Toxicology for the twentyfirst century. Nature, 460(7252), 208-212.
Kunz-Schughart, L. A. (2004). The Use of 3-D Cultures for High-Throughput Screening:The Multicellular Spheroid Model. Journal of Biomolecular Screening, 9(4), 273-285.
Lu, J., Einhorn, S., Venkatarangan, L., Miller, M., Mann, D. A., Watkins, P. B., & Lecluyse,E. (2015). Morphological and Functional Characterization and Assessment of iPSCDerived Hepatocytes for In Vitro Toxicity Testing. Toxicological Sciences, 147(1), 39-54.
-
会议会展
-
财报
-
焦点事件
-
项目成果
-
项目成果
-
科技前沿
-
项目成果
-
科技前沿
-
技术原理
-
项目成果
-
财报
-
焦点事件
-
焦点事件
-
项目成果
-
项目成果
-
企业风采
-
焦点事件
