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ELISA法检测细胞间黏附分子-1

2020.9.07

细胞黏附分子(ICAM)是存在于细胞表面的一类具有复杂功能的糖蛋白，介导细胞之间的相互黏附，参与众多的病理生理过程。目前，研究较多的黏附分子主要有免疫球蛋白超家族、整合素家族、选择性家族、Cadherin家族等。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)是黏附分子免疫球蛋白超家族中的一员，由内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞和上皮细胞表达，其配体是白细胞黏附分子CD18家族中的2个成员：即淋巴细胞功能相关抗原—1[lymphocyte function-aociated antigen-1，LFA-l(CDua／CDls)]和巨噬细胞抗原复合体-1[Mac-1(CD11a／CD18)]。正常肝组织中仅窦周细胞、门静脉血管内皮细胞有少量ICAM-1表达，肝细胞和胆管上皮细胞多为阴性。炎症反应过程中，ICAM-1是细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ECM)接触过程中起中心作用的一种细胞黏附分子，而炎症细胞表面的LFA-1与靶细胞膜上的ICAM-1结合是不可缺少的过程。近年来，许多研究表明：ICAM-1与LFA-l介导的细胞间黏附，与肝细胞坏死的发生有十分密切的关系，而阻断它们之间的相互作用或干扰它们的表达可能成为阻止肝细胞发生坏死的一种成功策略。由于ICAM-1与病毒性肝炎关系的研究是近年来肝病研究领域的新热点，检测方法和正常参考值的确立尚待完善。
[检测方法] ELISA法
[方法学原理] 本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人slCAM-1单克隆抗体包被于微孔板上，加入标本／标准品，使之与板上抗体结合，再加入HRP标记的单克隆抗体，未结合的部分被洗去，加入HRP的底物，若反应孔中有slCAM-1，将出现显色反应，加终止液终止反应。在450nm处测OD值，sI-CAM-1浓度与OD值之间成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中ICAM-l的浓度。
[试剂]
1．包被有抗人slCAM-1抗体的微孔板1块
2．HRP结合的抗人slCAM-1单克隆抗体0．1ml／瓶
3．0．5ml 100ng／ml slCAM-1标准品2瓶
4．50ml浓缩洗涤液20X1瓶
5．5ml浓缩检测缓冲液20Xl瓶
6。12ml样品稀释液1瓶
7．12ml TMB底物溶液1瓶
8．12ml终止液1瓶
9．封板胶纸2张
[仪器] 酶标仪或全自动酶联免疫检测
[检测步骤]
1.使用前先混匀所有试剂，应注意避免起泡。
2．确定好空白、标准及待测所需孔数(每一份标本、标准品、空白及随机选择的对照应测两次)。
3．从已平衡至室温的密封袋中取出所需的板条，洗板。
4．加样，在空白孔、标准品孔中加入100u1样品稀释液，在待测孔中加入90u1样品稀释液。
5．每份标本取10ul加入待测孔中，混匀。
6．在所有孔中加入50ul已稀释的HRP结合物，用封板胶纸封住反应孔，置于100rpm摇床上室温环境中(18～25℃)孵育1h，洗板。
7．在所有孔中加入100ul TMB底物稀释液，包括空白孔。置于100rpm摇床上，避光室温环境中(18～25℃)孵育约10min(视显色深浅灵活掌握)。
8．加入终止液(100u1／孔)终止反应，混匀后即刻测量OD450值。
注意：若孵育时未使用摇床则所获OD值较低，但仍然有效。
[注意事项]
1．试剂盒从冷藏环境中取出时应在室温环境中平衡30rain后方可使用，未用完的微孔条用自封袋密封保存。
2．酶标板洗涤时各孔均需加满洗涤液，防止孔内有游离酶不能洗净。应设定30～60s的洗涤浸泡时间。
3．滴加试剂前应将滴瓶翻转数次，使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确。
4．所有样品和废弃物都应按传染源处理。终止液为2mol／L硫酸，使用时应注意安全。
5．每批样本应同时做标准曲线。
6．若标本OD值在标准曲线测定范围以外，应适当稀释后重测。
[临床意义]
1．对TNF-β治疗的乙型肝炎感染，slCAM是很好的诊断指标。
2．眼葡萄膜炎、血管球性肾炎、HIV-1感染时，血浆slCAM-1升高。

elisa法黏附分子

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周锦帆