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高效检测谷物中的生物毒素

2020.3.16

本文介绍了采用改良型QuEChERS和 Bond Elut Mycotoxin SPE样品处理方法并结合三重四级杆液质联用系统检测谷物中的单端孢霉烯毒素和玉米赤霉烯酮，在降低分析成本的同时获得了极佳的检测灵敏度。两种样品制备方法均展示了良好的线性（R2≥0.995）。与免疫吸附这种被广泛认同的高效真菌毒素样品净化技术相比，本法测定加标小麦样品（50μg/kg，n=9）的回收率范围为72~105%（CV≤11%）。

真菌毒素是由霉菌产生的有毒次级代谢产物。其中镰刀菌属广泛存在于温带地区生长的小麦、玉米等谷物中，一旦感染，会导致农作物减产。根据感染品种的不同，可能会产生一系列单端孢霉烯族真菌毒素，目前已知的单端孢霉烯毒素有150多种。最常见的单端孢霉烯毒素为脱氧雪腐镰刀菌烯醇，而雪腐镰刀菌烯醇、镰刀菌烯酮-X、新茄镰孢菌醇等其他单端孢霉烯毒素也有发现。它们均属于A型或B型单端孢霉烯毒素，且具有相同的基本化学结构。玉米赤霉烯酮虽不属于单端孢霉烯毒素，但是它也可由多种镰刀菌产生。

欧盟委员会条例No?1881/2006规定了谷类粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的最大限量，后者的限量比原料规定的限量低。此前科研人员已成功应用气相色谱法对A型和B型单端孢霉烯毒素进行检测和定量，最近开发了采用LC/MS/MS同时测定A 型和B 型单端孢霉烯毒素和玉米赤霉烯酮的方法。本文对小麦中9种单端孢霉烯毒素及玉米赤霉烯酮进行LC/MS/MS测定时采用的两种样品制备方法的性能进行了比较。

方法和结果

样品制备采用改进的QuEChERS萃取法及分散SPE 法（d-SPE），或使用Bond Elut Mycotoxin SPE小柱进行的乙腈/水萃取法。分析单端孢霉烯毒素和玉米赤霉烯酮时，采用改进的QuEChERS（5g研细样品）和Bond Elut Mycotoxin SPE（25g研细样品）方法进行样品制备。

改进的QuEChERS方法

向每个装有研细样品的试管中加入甲醇/乙腈溶剂，涡旋。再加入含有4g MgSO4和1g NaCl的Bond Elut无缓冲盐萃取试剂盒。剧烈振摇试管并离心。取适量上清液转移至预先装有PSA/MgSO4（1:3）的试管中。若所取的上清液为2ml，则称取300mg MgSO4和100mgPSA手工制备2ml空白管。之后将样品体积减小到1ml，使用装有150mg MgSO4和50mg PSA的Bond Elut d-SPE萃取管进行操作。

Bond Elut Mycotoxin SPE方法

在第2种样品制备方案中使用Bond Elut Mycotoxin SPE小柱，500mg，3ml。先将等分提取样品流经SPE 小柱，再收集洗脱液并浓缩。SPE方法根据其非保留SPE机理，可用于清除样品中可能干扰ESI-MS/MS检测的基质组分。

操作条件

HPLC条件

色谱柱：ZORBAX快速分离高通量Eclipse Plus C18，2.1×100mm，1.8μm；仪器：6460三重四极杆液质联用系统，1290 Infinity液相色谱系统；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl；流动相A：水+0.2%乙酸，5mM乙酸铵；流动相B：甲醇+0.2%乙酸，5mM乙酸铵。

MS/MS条件

表1为安捷伦喷射流参数，表2为MS条件。使用MassHunter Optimizer 软件对MRM transitions和条件进行优化。根据分析中的流动相条件和流速来优化安捷伦喷射流参数。

本方法采用快速连续的极性切换，在检测灵敏度最高的电离模式下完成测量。方法既可采用静态MRM检测，也可采用动态MRM检测。当采用保留时间窗为1min、循环时间为500ms的动态MRM时，最多同时监测12个MRM通道，最小驻留时间为31.5ms，最大驻留时间为246.5ms。为保证准确定量，500ms的循环时间要求每个色谱峰至少包含20个数据点。图1为分析加标50ppb真菌毒素小麦基质的色谱图。

所有真菌毒素均具有良好的线性（R2≥0.995），小麦样品（50μg/kg，n=9）的回收率范围为72~105%（CV≤11%）。采用改进的QuEChERS方法最终提取物的LOQ范围为0.003~1.04μg/kg，而BE Mycotoxin SPE方法的LOQ范围为0.002~0.66μg/kg（见表4）。

小结

加标9单端孢霉烯毒素和玉米赤霉烯酮的小麦样品，浓度均为50μg/kg。通过与基质匹配的标准品比较计算来消除样品提取物中的离子抑制作用。改进的QuEChERS和Bond Elut Mycotoxin SPE两种方法均实现了分析物极佳的检测灵敏度。具有更高吸附容量的Bond Elut mycotoxin SPE操作可使净化更彻底，并可改善LOD（S/N＞3）和LOQ（S/N＞10）。两种样品制备技术的回收率范围为72~105%。改进的QuEChERS方法速度快、通量高、溶剂和吸附剂使用量少，显著降低了分析成本。

谷物生物毒素

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周锦帆