蜕皮激素调控诱导细胞基因表达实验
实验材料 带有荧光素酶报道基因并受蜕皮激素诱导表达的质粒带有感兴趣的基因并受蜕皮激素诱导表达的质粒pVgRXR培养的哺乳动物细胞
试剂、试剂盒 新霉素松甾酮 AZeocin培养液
实验步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液稀释到适当浓度。
新霉素
松甾酮 A
蜕皮激素的另一种类似物是 muristerone A(Sigma 公两)。
Zeocin
培养液
适合要转染的细胞生长的培养液
根据不同需要，培养液必须补充 Zeocin、新霉素和松甾酮 A。
附加试剂
本方案步骤 1、2 和 6 需要列在第 16 章适合的转染方案中的试剂。
本方案步骤 4 需要列在本章方案 6 中的试剂。
本方案步骤 8 需要列在第 6 章方案 8、第 7 章方案 8 或附录 8 中的试剂。
载体和菌株
带有荧光素酶报道基因并受蜕皮激素诱导表达的质粒（如 Invitrogen 公司的 pIND 系列）
带有感兴趣的基因并受蜕皮激素诱导表达的质粒
pVgRXR (Invitrogen 公司）
细胞和组织
培养的哺乳动物细胞
方法
1. 用 pVgRXR 稳定转染细胞，使用适合于所研究细胞的转染方法（转染方案的选择请见第 16 章)。
如果使用 pVgRXR, 就用 Zeocip 筛选带有该质粒的细胞。对于其他质粒，使用合适的抗生素获得稳定整合体集落。
2. 为了挑选在有蜕皮激素或其类似物存在时能够选择性诱导表达基因的克隆，用携带荧光素酶报道基因并受蜕皮激素诱导表达的质粒对步骤 1 中获得的 Zeocin 抗性集落 (转染方案的选择请见第 16 章）进行瞬时转染。
3. 转染后 24~96 h, 换上新鲜的含有 Zeocin、新霉素和 5umol/L 松甾酮 A 的培养液, 诱导荧光素酶的表达。细胞在 37°C 和5%~7%CO2 的潮湿培养箱中培养 20 h。
为了最有利于报道分子的诱导表达，松甾酮 A 的量和诱导时间的长短在不同细胞系之间会有变化。为了优化条件，在 0.1~1umol/L 的松甾酮 A 浓度范围内以及 16~72 h 诱导时间内进行尝试。
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