分子生物学常用实验技术（六）
一、材料
提纯TMV 病毒液（10mg/ml）。
二、设备
冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。
三、试剂
TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE 缓冲液，无RNA 酶的双菌水。
四、操作步骤
1、取一eppendorf 管加入提纯TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1 分钟，4℃下12000g 离心10 分钟。
2、吸取水相于一新eppendorf 管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。
3、吸取水相于新eppendorf 心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g 离心10 分钟。
4、取水相，加入1/10 倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5 倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。
5、4℃下12000g 离心15 分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g 离心5分钟。
6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5 分钟或空气干燥10 分钟，并溶于无RNA 酶的双菌水或TE缓冲液中。
7、取10ml 进行电泳分析，另10ml 用于cDNA 合成。
[注意] 1、整个操作应尽可能在低温下进行。
2、由于病毒RNA 镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。
第四节cDNA 合成技术
一、Riboclone M-MLV(H- ) cDNA 合成技术
Promega
公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA 合成系统采用M-MLV 反转录酶的RNase H 缺失突变株取代AMV
反转录酶,使合成的cDNA 更长。该系统的第一链合成使用M-MLV 反转录酶,cDNA 第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH 和DNA
聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4 DNA 聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括：
20μg 特异性引物
200μl M-MLV 第一链缓冲液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris?Cl pH8.3(37℃时); 375mmol/l KCl;
15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP 混合物(各2.5mmol/L)
2×625μ rRNasinR RNA 酶抑制剂
10,000μ M-MLV 反转录酶, RNase H-5μg 对照RNA
400μl M-MLV 第二链缓冲液(10×)，配方如下：
400mmol/L Tris?Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;
30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
500μ RNase H
500μ DNA 聚合酶Ⅰ
100μ T4 DNA 聚合酶Ⅰ
2×1.25ml 不含核酸酶的水
以上所有试剂除对照RNA 需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。
（一） 第一链合成
1. 试剂
[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM 和200mM)，TE-饱和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE 缓冲液。
2. 操作步骤
(1)
取一灭菌的无RNA 酶的eppendorf 管,加入RNA 模板和适当引物,每μg RNA 使用0.5μg
引物(如使用NotⅠ引物接头,使用0.3μg),用H2 O 调整体积至15μl, 70℃处理5
分钟,冷却至室温,离心使溶液集中在管底,再依次加入5×第一链缓冲液5μlrRNasin RNA 酶抑制剂25UM-MLV(H-
)反转录酶200UH2 O 调至总体积25μl
(2) 用手指轻弹管壁,吸取5μl 至另一eppendorf 管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),
用以第一链同位素掺入放射性活性测定。
(3) 37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1 小时
(4) 取出置于冰上
(5) 掺入测定的eppendorf 管加入95μl 50mM EDTA 终止反应,并使总体积为100μl。可取90μl 进行电泳分析(先用苯酚抽提),另10μl 进行同位素掺入放射性活性测定。第一链合成eppendorf 管可直接用于第二链合成
注：以上25μl 反应总体积中所用RNA 量为1μg,如合成5μg RNA,则可按比例扩大反应体积, 倒5μg RNA 使用125μl 总体积进行合成。
（二） 第二链合成
1、取第一链反应液20μl, 再依次加入10×第二链缓冲液20μ lDNA 聚合酶Ⅰ 23μ RNase H 0.8μH2O 加至终体积为100μl
2、轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出10μl 至另一eppendorf 管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。
3、14℃温浴2 小时(如需合成长于3kb 的cDNA, 则需延长至3-4 小时)。
4、掺入测定eppendorf 管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl 进行同位素掺入放射性测定,余下的可进行电泳分析。
5、cDNA 第二链合成离心管反应液70℃处理10 分钟, 低速离心后置冰上。
6、加入2μ T4 DNA 聚合酶, 37℃温浴10 分钟。
7、加入10μl 200mmol/L EDTA 终止反应。
8、用等体积酚:氯仿抽提cDNA 反应液,离心2 分钟。
9、水相移至另一eppendorf 管,加入0.5 倍体积的7.5M 醋酸铵(或0.1 倍体积的1.5M 醋酸钠,pH5.2), 混匀后再加入2.5 倍体积的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置30 分钟后离心5 分钟。
10、小心丢去上清液,加入0.5ml 冰冷的70%乙醇,离心2 分钟。
11、小心移去上清液,干燥沉淀。
12、沉淀溶于10-20μl TE 缓冲液。
（三）同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析
1. 试剂
1mg/ml 鲑鱼精DNA， 三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，碱性琼脂糖胶，碱性胶电泳缓冲液，（ 30mMNaOH，1mM EDTA），2×样品缓冲液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚蓝）。
2. 操作步骤
(1) 各取一2(5)中和二(4)反应液各3μl,点于玻璃纤维滤纸,室温干燥, 这些样品代表总放射性活性。
(2) 同样各取3μl 中反应液至含有100μl(1mg/ml)鲑鱼精DNA 中,混匀,加入0.5ml 5% TCA, 涡旋混合仪混合后置冰上5-30 分钟。
(3) 用玻璃纤维滤纸过滤,用冰冷的5% TCA 洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml 丙酮或乙醇漂洗,这些样品代表掺入放射性活性。
(4) 分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度,可用盖革计算器,也可用液闪计数。
3. 第一链产量测定
第一链掺入率(%)= 掺入cpm/总cpm ×100%
掺入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反应体积(μl)×(第一链掺入率)
设330 为每mol dNTP 的平均分子量
合成cDNA 量(ng)=掺入dNTP (nmol)×330ng/nmol
mRNA 向cDNA 转变率=合成cDNA 量(ng) / 模板RNA 量(ng)×100%
例如总放射性活性强度为254,000cpm, 掺入放射性活性强度为3040cpm, 所用RNA 摸板量为1μg,反应体积为25μl, 则:
掺入率＝3040/254000×100%=1.2
掺入dNTP 量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol
合成cDNA 量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng
mRNA 向cDNA 转变率=198nm/1000ng×100%=19.8%
由于1000ng RNA 中20%(5μl/25μl)用于掺入测定,而反应体积占总体积80%,因而实际第一链cDNA 合成量为0.8×198ng=158ng。
4. 第二链产量计算
除需去除第一链掺入dNTP 外,方法同第一链产量计算
第二链掺入率= 掺入放射性活性/ 总放射性活性??
掺入dNTP 量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反应体积(μl)－第一链掺入nmol]×第二链掺入率
第二链cDNA 合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol
双链cDNA 转变率=双链cDNA 合成量(ng)/ 单链cDNA 合成量(ng)
例: 第二链掺入放射性活性强度为2780cmp, 总放射性活性强度为235000cpm.
第二链掺入率=2780/235000×100%=1.18%
第二链合成dNTP 量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol
合成第二链cDNA 量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng
双链cDNA 转变率=155ng /158ng×100%=98%
一般cDNA 第一链转变率和双链转变率以12-50%和50-200%为好。
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综述
