激光散射技术在PSE 猪肉鉴定中的应用
猪肉是国人主要的动物蛋白源, 年消费量为 5380 万吨(2013), 约占世界年消费量的 50%[1]。但在 猪饲养业中存在大量的问题, 其中与肉品质相关的 有 PSE(pale, soft and exudative,指表面松软、多汁、 色泽灰白的肉)、DFD(dark, firm and dry, 指暗红色、 质地坚硬、表面干燥的肉)等, 每年因此而导致巨大 的经济损失, 故快速、精确地鉴别 PSE 肉, 预防 PSE 肉等劣质肉的产生是猪饲养业急需解决的问题。目前 大多是通过猪肉的物理特性(如 pH、感官检测等)或 几个单质蛋白特性来鉴别 PSE 肉, 基于系统观点以 混合蛋白为研究对象的方法报道极少。但目前的众多 实验现象表明, 仅用几个食品组分来表征食品的整 体性质是不可行的。
首先, 生鲜食品是一个非平衡态, 它的各种性质在时空的变化是多尺度的[2,3]; 同时, 食品的组分数多达几百个甚至更多, 且各组分间通 常都存在较强的相互作用。如何通过有限的几个物理 化学指标来标示食品的品质是食品科学一直在探讨, 同时也是亟待解决的问题。 第一个对光散射做研究的是英国剑桥大学的 J. Tyndall, 他提出了 19 世纪气象学的两大谜题: 为什 么天空是蓝的? Tyndall 的同事 L. Rayleigh 成功地解 释了这两个谜, 得出著名的 Rayleigh 定理。随后, Debye 首次将光散射理论应用到高分子溶液中, 得出 著名的 Debye 方程[4]; 1948 年, Zimm 在一张图上将角 度和浓度同时外推到零, 提出著名的 Zimm 作图法。 从此, 光散射技术成为一种应用于高分子溶液的经 典方法。 现代光散射技术包括动态光散射和静态光散射 两种。一般条件下, 光照射下溶液中的光散射粒子的 电子不会发生能级跃迁, 因此散射光与入射光两者 频率相同, 故激光光散射一般不考虑能量的转移, 仅 研究散射光强度及其角度对溶质浓度依赖性的关系。 通过测定时间平均散射光强的角度和浓度的依赖性 能够精确地得到高聚物的重均分子量 Mw、均方根旋 转半径(Rg 2 ) 1/2 和第二维里系数 A2 [5], 提供散射体的 大小和形状, 以及有关热力学特性等散射介质的特 性。
实际上, 介质中的质点或分子在不停地做布朗运动[4,6], 从而引起多普勒效应, 使得散射光的相位随 入射光频率发生变化, 这就是所谓的动态光散射[7], 又称为时间相关的光散射, 即测定光强随时间起伏 的变化规律[8]。它主要用于研究粒子的动态行为, 进 行动态光散射测定时, 利用快速时间相关仪记录散 射光强随时间的涨落即可得到散射光的特性衰减时 间, 进而求得平动扩散系数 D 和与之相对应的流体 力学半径 Rh。同时, 光强的时间相关方程和溶液的粘 弹性紧密相连, 并用来定量地测得溶液的流变特性。 由于该方法无需外加力场, 且用溶液中的纳米或微 米颗粒为探测子, 因此可用来探测溶液中细微结构 (尺度和决定该结构的力)。该方法叫微流变技术[9]。
目前, 光散射技术已广泛应用于高分子、聚合 物、陶瓷、染料、硅胶、医药、表面活性剂体系(胶 束)、脂质体、蛋白与多肽体系等领域, 它不仅测定 范围宽(从几纳米到几十个微米), 并且具有快速、简 便、分辨率高、重现性好、对样品无损等优点。Saber Trabelsi 等利用动态光散射技术研究了在不同 pH 条 件下长链聚合物与不同个数的球状蛋白结合前后, 其动态行为的改变[10]; Lorber 等[6]通过动态光散射技 术研究了温度、溶液黏度和分子间相互作用力的变化 对粒径大小的影响。 本文利用光散射技术测量猪肉总蛋白溶液的理 化特性参数, 由于该参数是由各种蛋白的相互作用 决定的, 因此, 它是一个食品品质的全局参数。本研 究一方面证明该参数可用来标定肉的品质, 并以此 为典型案例, 能推广激光光散射技术在食品科学— 特别是食品蛋白物化特性方面的应用, 为食品质量 安全检测提供一种新的方法。
2 材料与方法 2.1 材料与试剂 猪肉样品取自杭州某屠宰场的杜长大(100 kg 左 右)肥育猪, 第 5-6 腰椎间背最长肌, PSE 猪肉(由颜 色、pH 及表面渗出判断)样品部位相同。宰杀后 6 h 以内, 用碎冰保藏并于 2 h 内迅速转移至实验室, 切 成 100 g 左右的小块, 装于二层聚乙烯薄膜袋中, 置 于80 ℃超低温冰箱冷冻保存。 磷酸氢二钠, 磷酸二氢钠, 氯化钠, Tris, 柠檬酸,柠檬酸钠, 盐酸等所用试剂均为分析纯, 购于杭州市 捷程试剂有限公司; 实验中所配溶液用水均为来自 于 Thermo Scientific 的超纯水(电阻=18.2 M)。 2.2 仪器与设备 绞肉杯(JYL C020), 九阳料理机; 高速冷冻离心 机(D-37520), 德国 KENDRO 公司; AR2140 电子天平, 美国 OHAUS公司; 真空冷冻干燥机 (FD-1C-50), 北 京博医康实验仪器有限公司; ALV/CGS-3 一体式激 光散射仪, 德国 ALV 公司; Thermo 超纯水仪, 美国 THERMO 公司; Testo 206-pH1 便携式酸度计, 德国 TESTO 公司。
2.3 方 法 2.3.1 猪肉总蛋白的提取 猪肉总蛋白的提取参考了 Tan 等[11]的方法, 稍 作改动。将肉样在 4 ℃的冰箱中解冻后, 剔除脂肪和 结缔组织, 然后将猪肉样用绞肉杯绞碎成肉糜, 再准 确称取 20 g(准确至 0.0001 g)肉糜于 250 mL 烧杯中。 按样品质量、pH 缓冲液体积、氯化钠溶液体积 1:4:1 加入缓冲液和氯化钠溶液, 在 10℃恒温条件下辅之 以微速搅拌, 提取蛋白质 1 h。提取结束后再剧烈搅 拌 10 min(冰浴); 然后将烧杯中的物质转移至离心管 中, 于冷冻离心机中离心 20 min(4 ℃, 2000 r/min)。 取上清液用 4 层纱布过滤, 滤液即为所需的猪肉总蛋 白溶液。将该蛋白溶液分装于 50 mL 塑料离心管中, 并贮存于20 ℃备用。 2.3.2 猪肉总蛋白溶液的制备 将提取出来的蛋白溶液装入截留分子量为 3000 的透析袋中, 置于相应 pH 的蛋白提取缓冲液中, 于 4 ℃透析 18 h, 以除去蛋白溶液中的盐离子; 将透析 后的蛋白溶液于真空冷冻干燥机中冻干成粉末状, 测量前将该粉末重新溶解于相应浓度的 NaCl 溶液中, 于 4 ℃放置过夜, 以确保其充分水合, 以溶液中有沉 淀为宜。然后将充分水合后的蛋白溶液于高速离心机 中离心(4 ℃, 8000 r/min, 10 min), 上清液即为所需的 猪肉总蛋白溶液。 2.3.3 蛋白浓度的确定 由于在光散射测量过程中, 所测得光学信号来 自于两部分: 观察对象的热扰动和环境的热噪声。为 提高信噪比, 在光散射测量过程中, 蛋白浓度有一定 的下限。在我们实验室中, 环境热噪声的光强信号约 为 800 Hz, 因此来自于蛋白颗粒的光学信号应至少10 倍高于这一数值以得到满意的信噪比, 我们设定 溶液的光散射信号应大于等于 10 kHz[12]。同时, 蛋白 浓度也有一定上限。对于静态光散射, 由于测定范围 为 Zimm 图的线性区域, 因此没必要太高。对动态光 散射来讲, 应避免多重光散射现象。针对不同蛋白体 系, 在做光散射实验前, 预先确定蛋白测试范围[13]。 在本文中, 正常猪肉蛋白的浓度为 0.5 mg/mL~ 40 mg/mL, 即蛋白提取液原浓度到稀释 40 倍。 2.3.4 动态光散射测定 2.3.4.1 溶液散射光强的时间变化规律测定 取蛋白原液及其合适倍数的稀释液装入经丙酮 淋洗过的光散射专用小管中, 测量角度为 90°, 温度 为 25 ℃。进行动态光散射测试, 每次测试的时间为 60 s, 后暂停 600 s。该实验从稀释后立即进行直至持 续 24 h。 2.3.4.2 溶液中颗粒大小的测定 将蛋白原液及其合适倍数的稀释液装入已经丙 酮淋洗过的光散射专用小管后, 测量角度为 90°, 温 度设为 25 ℃, 进行动态光散射测试。每次测试时间 为 60 s, 每个样品重复测量 3 次, 该实验从稀释后立 即进行。 2.3.5 静态光散射测定 取蛋白原液及其合适倍数的稀释液装入已经丙 酮淋洗过的光散射专用小管中, 温度设为 25 ℃, 测 量角度从 30°旋转至 150°, 进行静态光散射测试。每 次测试 30 s, 每个样品重复测量 3 次, 该实验从稀释 后立即进行。 3 结果与分析 3.1 正常猪蛋白溶液的光散射测量结果 由于散射体积由入射光束和观察散射光强用的 光学光阑的交叉部分决定, 因此主要依赖于散射角。 在光散射实验中, 检测到的散射光强必须归一到恒 定的与散射角无关的散射体积中, 方法是以 sinθ(θ 为 监测器与入射光的夹角)因子进行校正[4]。因此, 当溶 液中散射颗粒为小尺度时(≤/64,为光散射试验中 的激光的光波长 632.8 nm), 散射光强 I 随入射角度 q(波向量, 4πn sin( ) 2 , n 为溶剂的折射率)呈现类似 于正弦函数的关系曲线[15], 如图 1 所示。但图 2 显示, 对于正常猪肉蛋白溶液, 无论是在低盐还是高盐条 件下, 其 I 均随 q 近似呈指数关系, 与小尺度分子条件下的结果相比具有显著差异。由此我们推测, 在实 验条件下, 正常猪肉蛋白溶液中均含有大尺度的结 构存在。同时由图 3 可知, 随着蛋白溶液存放时间的 延长, 正常猪肉总蛋白溶液的散射光强逐渐增大。根 据散射光强 I∝cR6 (c 为散射颗粒的浓度, R 为散射颗 粒的粒径) [15], 散射光光强得增大可能是由溶液中颗 粒粒径增大以及溶液中的散射颗粒浓度升高造成的。 但经过粒径的测定, 其贮存过夜前后基本没有发生 改变; 并且溶液中单体与聚合体浓度, 经过计算, 也 没有发生显著变化, 因此散射光强的改变可能归因 于在蛋白质溶液, 猪肉蛋白分子结构在过夜过程中 发生变化, 使得它的折射系数与溶剂的差值变大, 从 而使得溶液散射光的光强增大[14]。 该结果还显示该食品蛋白处在非平衡态, 它的 状态随时间变化, 即在食品中存在多空间和时间尺 度的变化, 和引言中的结论相吻合。 3.2 溶液环境对正常猪肉颗粒特性的影响 如图 2 所示, 在猪肉蛋白溶液中, I-q 的相互依赖 关系符合指数方程, 我们将该指数定义为该物系的 分维系数 df, 它反映了溶液中粒子结构的紧密度 (compact)。同时, 还能从中获取该结构的形成是由化 学反应还是扩散控制的[15]。低盐条件下(0.1 mol/L), 随着 pH 的增加, 正常猪肉总蛋白的分维系数逐渐减 小, 这说明 pH 对正常猪肉总蛋白的结构有着显著的 影响, pH 的升高将导致溶液中散射粒子的紧密度降 低。这非常容易理解, 随 pH 增大, 离蛋白的 pI(5.0 左右) [16]越远, 蛋白所携带的电荷增多, 使得分子间 的相互作用变大, 蛋白的多肽不容易靠近。高盐条件下(0.5 mol/L), pH 4.0 时其分维系数最大, pH 6.5 和 pH 9.0 时两者的分维系数几乎没有改变(见表 1), 即 在该两种 pH 条件下, 蛋白结构基本没有发生改变, 但与 pH 4.0 时的蛋白结构有显著差异; 同时, 相同 pH 条件下, 低盐与高盐条件下总蛋白的分维系数没 有显著变化。这一结果表明, 决定溶液蛋白相互作用 的主要作用来自于双电层力, 而由于离子氛导致的 屏蔽效应及吸附在粒子上的离子在不同粒子间的相 互关联作用是较弱的。同时, 由于离子屏蔽效应, 在 高盐条件下, pH 6.5 和 pH 9.0 时蛋白分子的双电层力 无显著变化, 使得 df 变化不明显。正常肉和 PSE 肉颗粒特性的比较 从上述实验结果, 我们不难看出, 激光光散射技术利用 I-q 图能分辨出猪肉蛋白溶液中的微小变化, 如蛋白分子携带的电荷变化, 游离离子的屏蔽效应 等。同时, 在整个测试过程中, 所需的溶液量少, 测 试时间短, 不直接接触溶液, 这些特点使得激光光散 射技术有成为快速食品检测技术手段的可能。为验证 此可能性, 我们用该技术测试 PSE 肉的蛋白溶液, 并 和正常肉作比较。
由图 4 可知, 不同溶液环境条件下, 正常猪肉总 蛋白溶液随着稀释倍数的增加, df 变化范围见表 2、 表 3, 在浓度为 10~200 μg/mL 范围内时尤为明显。这 归咎于在稀释过程中, 蛋白分子结构发生变化。当结 果在 0.1 mol/L NaCl 和 pH 4.0 时, 蛋白溶液稀释 20 倍和 50 倍, 散射光光强变化很小。这一实验结果进 一步证实了原先的假设: 在蛋白溶液中存在超分子 结构, 并且, 此结构随着蛋白溶液的稀释会发生改 变。如果不是这种情况发生, 随着溶液的稀释, 散射 光光强将明显降低, 特别是在我们的实验条件下, 蛋 白浓度降低了 2.5 倍(如无其他物理化变化发生, 仅 是稀释效应), 对应的散射光光强也要降低 2.5 倍左 右(此时的蛋白浓度很低, 分子间相互作用可忽略, 散射光光强由蛋白分子颗粒浓度决定)。同时, 当 NaCl 浓度为 0.1 mol/L 时, 随 pH 的升 高, 正常猪肉 20 倍和 50 倍蛋白稀释溶液的 I-q 线有 明显变化(见图 4、表 2)。在 pH 4.0 时, 如前所述, 几 乎无差异; 但 pH 6.5时, 两个溶液的测量值有非常明 显的差异。而在 9.0 时, 差异达到最大。这一结果说 明, 随着 pH 升高, 蛋白分子携带的电荷数增大, 形 成的超分子结构就越不稳定。在同样的稀释条件下, 超分子结构就越容易发生变化, 使得 I-q 的实验结果 图呈现明显差异。如前所述, 蛋白溶液存放过夜, 散射光光强升 高, 反映出在存放过程中蛋白分子的结构持续变化。
由图 5 和表 4 可知, 在相同实验条件下, PSE 肉 蛋白的 I-q 图形与正常猪肉的有差异。如在 0.1 mol/L NaCl pH4.0 时, PSE 肉蛋白溶液在放置过夜后, 它的 光散射光强随波矢的变化和稀释 5 倍条件下的仅有 微小差异。其背后的机制, 目前还在探索中。基本假 设是由于 PSE 肉的蛋白组成和正常猪肉的不一样, 较多蛋白存在部分变性[17], 这使得与正常猪肉相比, 蛋白溶液中的超分子结构以及决定它的结构的物理力有很大差异。但 10 倍稀释溶液却呈现出一个明显的 下降, 这有可能表明在 PSE 肉的蛋白溶液中, 当蛋白 浓度稀释到一定程度时, 该超分子结构能很快被破 坏。总体来看, 与正常肉蛋白溶液相比较, PSE 蛋白 原液的过夜放置产物, 其 I-q 线与稀释 5 倍的蛋白液 的 I-q 线更靠近。这和我们前面的假设猪蛋白变性对 超分子结构影响是相一致的。从图 4 和图 5 可看出来, 利用 0.1 mol/L NaCl pH 4.0 的提取液, 对正常猪肉和 PSE 肉的蛋白进行提取, 所得溶液用激光光散射技术测量 I-q 的依赖性, 能准 确快速的分辨出猪肉的品质。
4 结 论 本文从正常猪肉总蛋白入手, 通过激光光散射 技术对不同溶液条件下(pH 和 NaCl 盐浓度)I-q 的依 赖性进行测定, 得出 pH 和盐浓度都会产生一定的影 响(如表 1 所示): 无论在低盐还是在高盐条件下, 其 分维系数 df 均随 pH 的升高而减小, 且相同 pH 条件 下, 0.5 mol/L 条件下的分维系数要略小于 0.1 mol/L 条 件下。因此, I-q 图能非常敏感的揭示出蛋白分子相互 作用变化, 溶液中是否存在超分子结构, 该结构的大 致几何特征, 以及该结构受哪种物理力的影响最大。另外, 通过比较 PSE 猪肉和正常猪肉总蛋白的 I-q 图形特征, 我们发现 PSE 肉蛋白溶液确实和正常 猪肉有明显差异, 由于分维系数 df 与溶液中颗粒的 结构[18]有关, 相同溶液环境中, PSE 蛋白和正常猪肉 蛋白的 df 具有差异性, 说明两者蛋白分子具有明显 差异, 这和文献报道的 PSE 肉蛋白分子有部分失活 变性[19,20]相一致, 并在比较过夜放置溶液和不同稀 释倍数溶液的图形中再次得到印证。在 0.1 mol/L NaCl 和 pH 4.0 的提取液中, 两类蛋白溶液的 I-q 图形 有非常明显的差异, 因此激光光散射技术有潜在可 能作为快速评价鉴定猪肉的技术手段。它具有用时 短、用量少、样品无损且指标差异显著等优点, 同时, 它的测量结果来自于仪器, 避免了人为因素在品质 鉴定中的干扰。 目前, 我们正对 PSE 和正常猪肉蛋白的 df 差异 作进一步的机制研究, 并和其他常规的分析方法作 比较, 测定该方法的可靠稳定性, 以及在测量过程中 的干扰因素, 优化和确定该操作流程, 以实现光散射 技术成为生鲜肉制品行业中一种新的快速检测技术。
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