DNA的重组连接
目的：
了解T4DNA连接酶的几种生物学功能及用途；学习在T4DNA连接酶的作用下，载体与目的基因的几种不同的连接方式以及在标准的连接反应体系中，质粒载体和插入的外源DNA的比率关系和各自的用量；掌握用Pmd18-Tvector与PCR产物进行T-A克隆的机理及其应用。
原理：
外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5′-磷酸可生成4个新的磷酸二酯键。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯键。在这种情况下产生的两个杂交分子带有2个单链切口，当杂交体导入感受态细胞后可被修复。相邻的5′-磷酸和3′-羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下述反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起来。DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的DNA末端的浓度决定。不论末端位于同一DNA分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种DNA，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体DNA，再加作用的底物。如果反应中DNA浓度低，则配对的两个末端同一DNA分子的机会较大（因为DNA分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率）。这样，在DNA浓度低时，质粒DNA重新环化将卓有成就。如果连接反应中DNA浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA浓度高时，连接后的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。
一、材料
载体DNA
二、仪器
离心机、离心管、恒温水浴箱等
三、试剂
10×Buffer、无水乙醇、3mol/LNaAc、75%的乙醇、1×TE溶液、T4连接酶
四、方法
1、酶切反应
对质粒DNA的鉴定，只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增加。
A、在0.5mlEppendorf管中加重蒸水6µl10×Buffer1µl酶1µl混匀，37°C水浴1h以上。
B、取反应物点样，观察酶切效果。
C、酶切完全后，70°C5min终止反应。
2、加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/LNaAc混匀，-20°C2h以上。
3、离心15000rpm×15min,弃上清。
4、加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。
5、加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。
6、测定DNA的含量。
7、加入线性载体DNA和含量3～4倍于载体的待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20µ1，在12～14°C反应12～16h。
8、连接反应液可置-20°C保存，供转化用。
提示：
1、设立两个对照反应：
1）只有质粒载体
2）只有外源DNA片段
如果外源DNA不足，每个反应可用50～100ng质粒DNA，并尽可能多加外源DNA，同时保持连接反应体积不超过10ū1.可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。大多数制造厂商（除NewEnglandBiolabs公司外）现在都用单位（Weiss等，1968）对该酶进行标化。1个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970）或者60个粘端单位（如NewEnglandBiolabs公司所定义）。因此，0.015Weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶均为浓溶液（1～5单位/µl，可用20mmol/LTris·ClPh7.6)、60mmol/L、5mmol/L二硫苏糖醇、500µg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀释成100单位、ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的T4噬体DNA连接酶于-20°C保存3个月可保持稳定。
2、相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下4个条件：
1）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981)。
2）不存在亚精胺一类的多胺。
3）极高浓度的连接酶（50Weiss单位.Ml）。
4）高浓度的平端。
在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成聚集体的物质（凝聚体）、如聚乙二醇或氯化六氨合高钴，可以使如何取得适当浓度的平端DNA的问题迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两个作用：（1）它们可使平端DNA的连接速率加大1～3个数量级，因此可使连接反应在酶和DNA浓度不高的条件下进行。（2）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律使分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的DNA浓度下，所有的DNA产物也将是线状多聚体。
（1）聚乙二醇（PEG8000）:
A：用去离子水配制成的PEG8000储存液（40%）分装成小份，冰冻保存，但加入连续反应混合物之前应将其融化并达到室温。在含15%PEG8000的连接反应混合物中，对连接反应的刺激效应最为显著。除PEG8000和T4噬菌体DNA连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于0°C混合，然后加适当体积的PEG8000（处于室温），混匀，加酶后于20°C进行温育。
B：连接混合物中含有0.5mmol/LATP和5mmol/LMgcl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或Mgcl2度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。
C：浓度为15%的PEG8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10～100倍，反应的主产物时串联的多联体。
Ⅳ：PEG8000可刺激短至8个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这方面，它于氯化六氨合高钴有所不同。
（2）氯化六氨合高钴
Ⅰ：氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存于-20°C，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐浓度为1.0～1.5µmol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50倍，但只能使粘端连接的效率提高到原来的5倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。
Ⅱ：在单价阳离子（30mmol/LKCL）存在下，它对平端连接仍由一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再使清一色的分子间连接产物，相反，环状DNA将占尽优势。
Ⅲ：与PEG8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。
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