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电子显微镜生物标本的制备及观察实验-2

2019.10.01

实验方法原理	电子枪发射出的热电子，在加速电压作用下，形成高速电子流，经聚光镜和物镜的作用形成一极细的电子束，扫描于标本表面。入射电子与标本中的原子相互作用产生二次电子，二次电子的数量和每个电子的能量随标本表面形状及元素成分的不同而变化。二次电子被接收并经过放大，即可在荧光屏上显现出被放大的标本表面图像。
实验材料	家兔
试剂、试剂盒	扫描电子显微镜超薄切片机解剖镜震荡器恒温箱干燥器离子镀膜机单面刀片铜网解剖器材
仪器、耗材	乙醚戊二醛二甲砷酸钠缓冲液锇酸乙醇丙酮环氧树脂包埋剂醋酸铀染液柠檬酸铅染液单宁酸乙酸异戊脂
实验步骤	一、取材 1. 麻醉家兔，解剖暴露支气管，用刃器切取小段支气管，剖开。 2. 再切取2x5 mm 大小的一块管壁，保护要观察的内表面（即粘膜面），并用缓冲液或生理盐水清洗二次。 3. 如粘膜表面有较多粘液时，可用胰酶溶液消化，再清洗。二、固定 1. 把标本迅速投入固定液中，其固定程序与透射电镜标本同。三、导电处理 1. 把经锇酸固定的标本清洗后放入2%单宁酸中处理10分钟。 2. 再用双蒸水清洗3次，然后放入1%锇酸中处理30分钟。四、脱水 1. 把用双蒸水洗过的标本依次放入30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇中脱水各10分钟。 2. 然后将标本移入乙酸异戊酯中，置换出乙醇。五、临界点干燥 1. 临界点干燥是扫描电镜标本制备的一种重要干燥方法，它能消除表面张力，使标本在干燥过程中不损伤、不变形。 2. 将标本置入临界点千燥器的密闭标本室中，打开进气阀门，充入液体CO₂，其量不少于标本室容积的2/3。 3. 关闭开关，并升温使达到临界状态（31.4℃，72.8大气压），此时液态与气态界面消失。 4. 加温过程中温度可达40℃，标本室内压力可达80~120大气压，然后缓慢放气，放气时间不应少于2小时。图1 扫描电子显微镜构造原理及主要部件六、镀膜 1. 把干燥的标本用导电胶固定在标本台上（注意观察面向上），把标本台放在离子镀膜机阳极载台上。 2. 在低真空下（0.1 Torr）加高电压（1 000~1 200伏）使阴极（金靶）与阳极间形成电场，把残存的气体分子电离，阳离子打向金靶，金原子溅射出来落在标本表面，形成一层金膜。 3. 这不仅保存了组织表面形态，而且电子束射到标本上容易激发二次电子，并有良好的导电性能，可产生质量好的图像。七、观察支气管纤毛上皮的表面立体超微结构 1. 支气管纤毛上皮表面结构：支气管粘膜表面有许多纤毛，纤毛排列密集，是由纤毛细胞顶端发出的，在纤毛间可见有杯状细胞，在杯状细胞的表面有长短不一的微绒毛。展