胰蛋白酶的制备及活力的测定(2)
三、仪器
食品加工机和高速分散器；研钵；大玻璃漏斗；布氏漏斗；抽滤瓶；纱布；恒温水浴；紫外分光光度计；秒表；pH试纸。
操作方法
一、猪胰蛋白酶制备
（一）猪胰蛋白酶原的提取
猪胰脏1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎。
加入2倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃搅拌提取24小时，四层纱
布过滤得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5升）。
加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过
夜后抽滤（挤压干），得猪胰蛋白酶原粗制品。
（二）胰蛋白酶原激活
向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶
解，得胰蛋白酶原溶液。将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计），使 Ca2+与SO42-结合后，边加边搅拌均匀，边加边搅拌，使溶液中最终仍含有0.1M CaCl2。
2．用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）轻轻搅拌，于室温下活化8～10小时，（2～3小时取样一次，并用0.001M HCl稀释），测定酶活性增加的情况。
3．活化完成（比活约3500～4000BAEE单位）后，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，抽滤除去CaSO4沉淀。
（三）胰蛋白酶的分离
1．将已激活的胰蛋白酶溶液按242克/升加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼。
2．滤液按250克/升加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到0.75，放置数小时，抽滤，弃去滤液。
（四）胰蛋白酶的结晶
1．将上述胰蛋白酶滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解。
2．用2M NaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。3．放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/4～1/5的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。
4．放置2～5天可得到大量胰蛋白酶结晶，待结晶析出完全时，抽滤，母液回收。
（五）胰蛋白酶的重结晶
将第一次结晶的胰蛋白酶产物进行重结晶：用约1倍的0.025M HCl，使上述结晶分散，加入约1.0～1.5倍体积的pH9.0
的0.8M硼酸缓冲液，至结晶酶全部溶解，取样后，用2M
NaOH调溶液pH至8.0（准确）（体积过大，很难结晶），冰箱放置1～2天，可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母液回收)，冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。
二、胰蛋白酶活性的测定
以苯甲酰L—精氨酸乙酯（英文缩写为BAEE）为底物，用紫外吸收法进行测定。苯甲酰L—精氨酸乙酯在波长
253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲酰L—精氨酸（英文缩写为BA）。在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰L—精氨酸逐渐增多，反应体系的紫外吸收宜随之相应增加。
取2个光程为1厘米的带盖石英比色杯，分别加入25℃予热过的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L
HCl，作为空白，校正仪器的253nm处光吸收零点。再在另一比色杯中加入0.2ml待测酶液（用量一般为10微克结晶的胰蛋白酶），立即混匀并记时，每半分钟读数一次，共读3~4分钟。控制DA253/min
在0.05 ~ 0.100左右为宜。
绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率（即初速度）DA253/min。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE为底物反应液pH8.0，25℃，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定DA253，每分钟使DA253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。
胰蛋白酶溶液的活力单位（BAEE单位/ mL）＝
胰蛋白酶比活力（BAEE单位 / mg ）＝
注意事项
（1）胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或立即低温存放的，否则可能因组织自溶而导致实验失败。
（2）在室温14～20℃条件下8～12小时可激活完全，激活时间过长，因酶本身自溶而会使比活降低，比活性达到 “3000～4000BAEE单位/mg蛋白”时即可停止激活。
（3）要想获得胰蛋白酶结晶，在进行结晶时应十分细心地按规定条件操作，切勿粗心大意，前几步的分离纯化效果愈好，则培养结晶也较容易，因此每一步操作都要严格。酶蛋白溶液过稀难形成结晶，过浓则易形成无定形沉淀析出，因此，必需恰到好处，一般来说待结晶的溶液开始时应略呈微浑浊状态。
（4）过酸或过碱都会影响结晶的形成及酶活力变化，必须严格控制PH。
（5）第一次结晶时，3～5天后仍然无结晶，应检查pH，必要时调整pH或接种，促使结晶形成。重结晶时间要短些。
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