信使RNA的检测、分析及定量介绍
方法 | 目标RNA的类型 | 同时定量的目标RNA的数量 | 用途 | 缺点 |
|---|---|---|---|---|
Northern杂交 | mRNA | 通常为一个，最多几个。 | 主要用于估测不同组织、细胞中目标mRNA的分子质量，可用于mRNA的粗略定量。 | 需要大量RNA；只可同时检测一个或最多几个mRNA；与PCR方法相比，灵敏度差、耗时。 |
RNA酶保护 | mRNA | 通常为一个，但是如果使用混合探针，最多可同时检测12种mRNA。 | 主要用于对不同类型细胞或组织中目标mRNA的检测和定量。 | 需要特异性的反义杂交探针（通常带放射性）。RNA酶保护法远比Northern杂交灵敏，但灵敏度还是不如PCR法。 |
传统反转录PCR | mRNA | 通常为一个，但是也可努力做到多重检测系统。 | 是检测目标RNA的高灵敏度方法，即使目标RNA在细胞中拷贝数很低也可检测。主要用于检测不同细胞和组织中mRNA的相对丰度。 | 由于反转录PCR取决于反转录步骤和扩增步骤所使用的引物，经常可能出现假阳性结果；反转录步骤变化大；另外，产物量的测定方法有很多缺陷，如低分辨率和低灵敏度。 |
实时定量PCR | mRNA及miRNA | 通常为一个，但也可检测多个目标RNA，参见Stanley和Szewczuk（2005）等的研究结果，他们在单个多重反应中同时分析过72个mRNA。 | 是检测目标RNA的一种高灵敏及高精度的方法。即使目标RNA在细胞中拷贝数极少也适用。实时PCR比其他方法更灵敏、更快、更精确。最近10年内是检测细胞中mRNA相对丰度的主要方法。不仅可用于mRNA的检测，也可用于microRNA的检测（参见Chen et al. 2005；Benes and Castoldi 2010）。 | 市场上销售的几种商业设备采用的检测方法不同。另外，已出版了数百种描述实时定量PCR的方案。实时PCR的每个步骤都缺乏标准，导致可靠性和可重复性的比较即使可能，也很困难（Nolanet al. 2006；Derveaux etal. 2010）。对实时PCR提出了一些合理的建议和标准，规定了实时PCR结果发表所必需的最少信息量，也许会有助于解决目前的困境（Bustinet al. 2009；Bustin 2010）。 |
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