分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

聚丙烯酰胺等电聚焦电泳测蛋白质的等电点-2

2020.9.01

四、固定、，染色和脱色

将凝胶板放在培养皿中，加入固定液，浸泡数小时后，用脱色液清洗两次，每次10min, 然后加入染色液，室温下放置15－30min，再用脱色液洗脱数次，直至谱带清晰，放入保存液中浸泡10min,可制干板。

五、制作干胶板

1. 取完全浸湿的平整玻璃纸一张，于玻璃板上铺平，纸与板之间不可有气泡。

2. 将凝胶铺于上述玻璃纸上，对齐中心位置，使四边留出距离相等，随后将胶与纸之间的气泡轻轻赶跑。然后，把另一张玻璃纸折起盖在胶面上，并与下层玻璃纸对齐，胶与两层玻璃纸之间要绝对避免气泡，要求光滑平整。

3. 将凝胶四边上下两层玻璃纸贴紧，使胶边边缘上完全没有气泡。然后将各边的玻璃纸多余部分折向玻璃板反面。

4. 置于室温中自然干燥，完全干燥后的胶板，手感如触及玻璃板。这时，可将胶板揭下，裁去边角多余的纸，即可得一张图谱清晰的干胶板。

注意事项

（1）支持介质

在IEF-PAGE中，丙烯酰胺純度极为重要，Acr及Bis中如有丙烯酸，则引起聚焦后pH剃度漂移，一般需用重结晶法进一步纯化Acr及Bis。最近Pharmacia公司推出Amberlite MB-6除去丙烯酸，其效果较再結晶法更佳。

（2）两性电解质载体

两性电解质载体是IEF-PAGE中最关键的试剂，直接影响pH梯度的形成，以及蛋白質

的聚焦。因此，要选用优质的两性电解质载体，在凝胶中，其终浓度一般为1-2%。pH梯度的线性依赖于两性电解质的性质，选择哪种pH梯度范围的两性电解质载体，則与被分离蛋白质的pI有关。

（3）样品预处理与加样方法

实验证实，盐离子可干扰pH梯度形成，并使区带扭曲。为了防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用Sephadex G-25脱盐，也可将样品溶解在水，或是低盐缓冲液中，使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。但某些蛋白质在等电点附近，或水溶液及低盐溶液中，溶解度较低，則可在样品中加入两性电解质，如加入1%甘氨酸或对1%甘氨酸透析，虽然甘氨酸是两性电解质，但不影响pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶极距作用增加蛋白質的溶解性。此外，还可在样品及凝胶溶液中加入无离子去污剂如Tween 80, Triton X-100, Nonide P-40等或加入相同浓度的尿素(4 M)，以免氰酸盐引起蛋白质的胺甲酰化，含有尿素的样品及凝胶板只能当天使用。

加样量取决于样品中蛋白质的种类、数目及检测方法的灵敏度。如用银染色，加样量可减少到1 μg。一般样品浓度以0.5-3 mg/ml为宜，最适加样体积为10-30 μl。如样品很浓，可直接在凝胶表面加2-5 μl；如样品很稀，可加样300μl。值得注意的是：对不稳定的样品可先将凝胶进行15-30 min预电泳使pH梯度形成，然后将样品放再靠近pI的位置以缩短电泳的时间，但不要将样品正好加在pI处和紧靠阳、阴极的胶面上，以免引起蛋白质变性造成区带扭曲。一般加样电泳半小时后，取出加样滤纸以免引起拖尾現象。

（4）电功率、时间等因素

在IEF电泳中，随着样品的迁移越接近pI时，电流则越来越小。为使各成分能更好

地分离，要保持一定的电功率，就应不断增加电压，电压增高可缩短pH梯度形成，和蛋白质分离所需的时间，但过高的电压会使凝胶板局部范围过热，因此，在电泳过程中，应通冷却水，水温以4-10℃为宜，流量5-10 l/min。一般宽pH范围电泳时间以1.5-2 h为宜。

互联网

喜欢作者我要约稿

喜欢作者

打赏方式

聚丙烯酰胺等电聚焦电泳测蛋白质的等电点-2

周锦帆