胚胎中细胞基因打靶方法

2019.5.20

胚胎中细胞基因打靶方法

置换型设计物的制备

1．选择靶基因的一个部分作为设计物的组成，还包括有靶基因的另一个部分作为Southern杂交探针，以鉴定细胞中是否已发生同源重组之用。

2．在质粒载体中构建一个克隆；neo基因能阻断靶基因的表达，在neo的两侧保持保留同源区；在同源区外的置换型设计物中包含一个胸腺嘧啶激酶（TK）基因。

3．用限制性内切酶消化设计物DNA使成线形；设计物DNA线形化后，质粒DNA仍附于在TK基因上。如果设计物在基因组发生随机插入中出现任何DNA序列丢失时，线性态有助于保持TK基因的活性。

4．用酚/氯仿抽提设计物DNA。

5．用加两个体积的95％乙醇沉淀，微型离心机离心30秒，去上清，使沉淀物干燥到仍保持微湿润状态。

6．把沉淀物溶于100μl水中，检测是否已被彻底消化，在凝胶电泳中测定DNA的浓度。

转染设计物和ES细胞的选择

7．把细胞培养在ES/LIF培养基中；每2～3天传代细胞，把细胞接种到100mm凝胶培养皿上，每皿1～2×10⁶细胞。

8．用胰蛋白酶/EDTA消化收集细胞达5×10⁶～1×10⁷；消化5分钟，令细胞完全脱壁，用吸管吹打使分散成单细胞，加5ml ES培养液，用1ml电击液重悬于同一管中。

9．加1 pmol消毒线性DNA。

10． 450V，250μF在4mm电击小室中进行电击；室温中培养10分钟。

11．把ES细胞培养在ES培养液中，按1～2×10⁶细胞/100mm凝胶培养皿上，培养24小时。

12．更换入含有G418（2mg/ml终浓度）和GANC（2μM终浓度）的ES/LIF培养液中，进行筛选。

13．继续培养，每日更换一次ES/LIF培养液和加有G418（2mg/ml终浓度）及GANC（2μM终浓度），继续筛选直到单个、分离的克隆出现为止（典型情况下，电击后1周内出现）；用一个高压消毒过的吸管从培养皿中分离出单个克隆，置入35μl胰蛋白酶/EDTA液中消化5分钟；反复吹打5次分散细胞，把细胞转入铺有凝胶和每孔含有1ml ES/LIF培养液24孔培养板中。