PCR扩增分离目的DNA片段实验原理、材料和步骤（二）
三、材料
（一）仪器与器皿
PRC 扩增仪（PE2400），琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性指形管，凝胶成像仪,玻片
（二）试剂与材料
1．琼脂糖凝胶电泳试剂
1）电泳缓冲液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA
2）加样缓冲液：0.25%溴酚兰40% w/v蔗糖
3）溴化乙锭溶液：0.05mg/ml溴化乙锭/水
4）琼脂糖
2．TaqDNA 多聚酶
3．5′反应缓冲液：125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/mlgelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25%
4．混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2mmol/L)
5．DNA 模板（每2′ ml 中含有10fg 待扩增DNA）
6．引物 1 （25pmol/L），5’加入EcoRI 粘性末端碱基
7. 引物 2 （25pmol/L），5’加入HindIII 粘性末端碱基
8. 无菌水
四．实验步骤
1.按顺序在200ml 指形管中加入以下试剂与样品：（因购入的试剂批次不同，加样时有
所差别，以预实验结果为准。）
1） ddH2O 74ml
2） 10′Buffer 10ml
3） MgCl2 6ml（10′Buffer 如已加入MgCl2，则不必加）
4） dNTP 2ml
5） 引物1 2ml
6） 引物2 2ml
7） 模板 2ml
8） TaqDNA聚合酶2ml
总体积共100ml（也可以配成40ml 的反应体系）
2. 在PCR 扩增仪上按以下反应条件编入程序：（以下为参考值，因扩增的DNA片段不同，各类PCR扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA 片段的要求及仪器而定参数，见示范。）
1．预变性 94℃ 2 分种
2．循环条件（30 次）
变性 94℃ 40 秒
复性 55℃ 35 秒
延伸 72℃ 2 分10 秒
3．延长延伸 72℃ 7 分钟编完反应程序，置反应管于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。
4. PCR 扩增完毕，配2%琼脂糖凝胶，取15ml 反应液及相适应的PCR mark 分别点样，加样缓冲液应为40%W/V 蔗糖，电泳观察结果。
5. 凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的 DNA 片段
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综述
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