PCR仪--PCR注意事项及解决方案
1、PCR 污染
PCR 技术的敏感性极高，极微量的污染即可导致假阳性的产生，因此，了解 PCR 污染的原因，采取相应的措施预防和消除 PCR 污染就十分重要。PCR 污染主要是随机污染，包括 PCR 反应前污染及反应后污染。
（1）PCR 反应前污染
主要是样品 DNA 的交叉污染。提取 DNA 使用的仪器上残留的杂质 DNA 或反应管中残留的 PCR 产物、PCR 操作者皮肤或头发等均可引起样品污染。其中 PCR 产物的污染，也称残留污染（carryover），是引起样品交叉污染的主要因素。明胶、Taq DNA 聚合酶等 PCR 反应试剂等均有可能带有杂质 DNA，因此也可导致 PCR反应前污染。
（2）PCR 反应后污染
PCR 反应后污染主要来自于 PCR 产物检测过程，如电泳上样、点杂交点样时加样器吸头之间的污染等。
（3）潜在的 PCR 污染源
主要包括3个方面：①仪器设备的污染，样品收集器、微量加样器、点杂交器、离心管、离心机、切片机、pH计、水浴锅、高压锅及 PCR 仪等的污染；②试剂污染，乙醇、液氮、氯仿、酶及其他生物制品（如明胶等）的污染；③操作者的污染，操作者的皮肤、头发等均可引起 PCR 污染。
2、污染的预防
进行 PCR 反应时，遵照下列规则有助于防止 PCR 的污染。
（1）PCR 的前处理和后处理在不同的房间或不同的隔离工作台上进行。即整个 PCR 操作要在不同的隔离区（标本处理区，PCR 扩增区，产物分析区）进行，特别是阳性对照需在另一个隔离环境中贮存、加入。
（2）试剂要分装，每次取完试剂后盖紧塞子。PCR 反应时将反应成分制备成混合液，然后再分装到不同的反应管中，这样可减少操作，避免污染。
（3）改进实验操作，戴一次性手套，PCR 实验应配置专用的微量可调加样器，这套加样器绝不能用于 PCR 反应产物的分析。用一次性移液器吸头、反应管，避免反应液的飞溅等。
（4）检查结果的重复性。
（5）经常处理仪器设备等潜在的 PCR 污染源，减少污染的可能。
3、实验中的对照
每一次试验都需要设置严格的对照。阳性模板作为阳性对照；阴性模板或不加模板作为阴性对照。
4、扩增反应为阴性结果（无产物）时应采取的措施
（1）取 10μL 扩增混合液作模板再进行 PCR 扩增。
（2）增加 Taq DNA 聚合酶的浓度。
（3）增加靶 DNA 量。
（4）若模板为粗制品，提纯样品。
（5）增加扩增循环次数。
5、PCR 产物纯化
PCR 反应完成目标 DNA 的扩增后，PCR 产物可以用于进一步的研究，例如用于 DNA 测序、克隆、分析基因的功能和表达等。然而，通过 PCR 反应后体系中仍然存在具有活性的 DNA 聚合酶，剩余的 dNTP、引物以及反应缓冲体系中的各种金属离子等。因此，我们必须通过一定的方法从反应体系中提纯 PCR 反应的扩增产物，才有利于进一步的分析研究。然而，实验表明使用常规的苯酚/氯仿、乙醇沉淀等提取法并不能分离和灭活耐热DNA 聚合酶。而这些存活的 DNA 聚合酶对后续的 PCR 产物的克隆等研究造成不同程度的影响，例如 DNA 聚合酶会使由限制性内切酶消化产生的3'末端凹陷被重新填充，因此，耐热的 DNA 聚合酶的灭活分离一度成为多个实验室克隆 PCR 扩增产物中遇到的一大难题。常规的 PCR 产物纯化的基本过程如下：首先使用琼脂糖凝胶电泳分离除去反应体系中靶序列的非特异性扩增片段，然后使用蛋白酶 K 灭活耐热的 DNA 聚合酶，此后使用常规的苯酚/氯仿抽提法除去剩余的 dNTP，离心、乙醇洗脱后干燥，最后使用高效液相色谱或者凝胶电泳分离反应体系中剩余的引物和引物二聚体。通过琼脂糖凝胶电泳-溴化乙啶染色可以鉴定所提纯的 PCR 反应产物的纯度。
6、假阳性
假阳性是指出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。产生的原因有：①引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的序列；②靶序列太短或引物太短；③靶序列或扩增产物的交叉污染。解决方法有：操作轻柔，防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外造成污染；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材高压消毒；离心管及加样枪头等一次性使用。必要时，可在加标本前，将反应管和试剂用紫外光照射，以破坏存在的核酸。
7、假阴性
假阴性是指不出现特异扩增带，可能原因：引物设计不合理，酶失活或酶量不足，模板量太少，退火温度不合适，循环次数过少，产物未及时电泳检测等。解决方法有：重新设计引物，增加酶量或调换酶，增加模板量，调整退火温度，增加循环次数，及时检测扩增产物，一般在 48h 以内进行。
-
招标采购
-
焦点事件
-
综述
-
焦点事件
-
焦点事件
-
焦点事件
-
焦点事件
-
焦点事件
-
技术原理
-
技术原理
-
技术原理
-
焦点事件
-
焦点事件
