应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR）
实验方法原理 反转录 PCR ( reversetranscriptase'PCR，RT-PCR ) 是一种从 RNA 扩增 cDNA 拷贝的方法。RT-PCR 对于获得与克隆 mRNA 的5'、3' 末端序列和从非常少量的 mRNA 样品构建大容量的 cDNA 文库方面都是极为灵敏与通用的方法。
实验材料 反转录酶DNA 聚合酶外源参考 RNA
试剂、试剂盒 扩增缓冲液氯仿dNTP 的贮存液乙醇酚氯仿胎盘 RNase 抑制剂
仪器、耗材 琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶屏蔽型枪头离心管或微量滴定板正向排液式移液器PCR 仪水浴箱
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液与溶液
10X 扩增缓冲液
氯仿
4 种 dNTP 的贮存液（20 mmol/L，pH 8.0)
乙醇
MgCl2 ( 50 mmol/L)
酚：氯仿（1:1，V/V)
胎盘 RNase 抑制剂（20 单位/μl )
2. 酶与缓冲液
反转录酶（RNA 依赖的 DNA 聚合酶）
热稳定的 DNA 依赖的 DNA 聚合酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶
4. 核苷酸与寡核苷酸
外源参考 RNA
用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物
oligo ( dT）12~18 溶于 TE ( 100 μg/ml，pH 8.0)
随机六核苷酸溶于 TE ( 1 mg/ml，pH 8.0）
基因特异性寡核苷酸（20 μmol ) 溶于水（终浓度 20 pmol/μl)
正义与反义寡核苷酸引物用于 cDNA 的 PCR 扩增
总 RNA ( 100 μg/ml ) 或带 poly (A) + RNA ( 10 μg/ml ) 溶于水中
1. 一只盛有 10~100 个细胞的离心管，在 4℃ 下离心 5s，沉淀样品。
2. 吸弃上清液，加 10~20 μl 冰冷裂解液。非常轻微地振荡离心管，使细胞分散于裂解液中。
3. 离心管在冰浴上放置 5 min, 然后在 4℃ 高速离心 2 min，上清液可直接用于 RT-PCR 的模板。
5. 特殊设备
自动微量移液器的屏蔽型枪头
离心管（0.5 ml, 薄壁扩增反应专用离心管）或微量滴定板
正向排液式移液器
PCR 仪
水浴箱水温设置在 75℃ 和 95℃
二、方法
1. 转移 1 pg~100 ng 的 poly(A) + RNA 或 10 pg~1 μg 的总 RNA 到一只新的离心管。
用水调整体积至 10 μl；将 RNA 样品在 75℃ 变性 5 min, 将离心管迅速插入冰中冷却。
2. 对含有这种变性的 RNA 样品的离心管内依次加入如下试剂：
10X 扩增缓冲液 2 μl
20 mmol/L 4 dNTP 混合液（pH 8.0） 1 μl
引物（最优先的，见下面） 1 μl
约 20 单位/μl 胎盘 RNase 抑制剂 1 μl
50 mmol/L MgCI2 1 μl
100~200 单位/μl 反转录酶 1 μl
H2O 补足至 20 μl
温育在 37℃ 反应 60 min。MgCl2 为反转录酶作用所必需。
设置 3 支阴性对照管。在一支对照管中加入合成第一链 cDNA 反应所需要的所有试剂，但不加模板 RNA；第 2 支对照管加入除了反转录酶外的所有试剂；第 3 支对照管加入除了引物外的所有试剂。这些对照管进行所有后续的实验步骤。设置这些对照管能保证 cDNA 产物不是由于污染或由 RNA 的自身引导所致。
3. 将反应管在 95℃ 加热 5 min，使反转录酶失活和 RNA-cDNA 杂合物变性。
4. 调整反应混合液体积以便正义和反义引物浓度在 20 pmol/L。
5. 离心管内加入如下反应试剂：
1X 扩增缓冲液（或调整反应体积至 99 μl） 77 μl
1~2 单位热稳定 DNA 聚合酶 1 μl
6. 如果 PCR 仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油（约 50 μl）。如果应用热启动 PCR 程序，在反应混合液的上层加一层石蜡油。放置离心管或微量滴定板在 PCR 仪上。
7. 扩增反应有交性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度列表如下：
8. 抽取每种扩增样品 5~10 μl，用琼脂凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析扩增结果，用 DNA marker 来判断扩增片段的大小。凝胶一般用 EB ( 溴化乙锭）或 SYBR 金颗粒染色来观察扩增的量与片段大小。
9. 若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层（步骤6)，反应结束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。
10. 把扩增产物克隆到已经制备好的相应的载体上。克隆之前，从扩增的 DNA 产物中分离去除残余的热稳定 DNA 聚合酶和 dNTP。然后，DNA 片段可以连接到一种平末端载体或 T 载体，或者用限制性内切核酸酶进行酶切后，再连接到具有相应末端的载体上。
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