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双色同步成像在荧光共定位等成像实验中的应用（二）

2020.6.01

双色同步成像——一台Flash 4.0 LT相机作两台用

采用W-View GEMINI这样的双色分光附件将两种颜色的信号成像到一台相机的一个感光芯片上很好地解决了同步成像的时间问题，但对于绝大多数的相机，整个感光芯片只能设置一个曝光时间，当两个颜色的信号强度相差较大时将很难同时将两个颜色的成像信噪比保证在最佳状态。

而滨松Flash 4.0 LT则可以分别调整同一芯片上下两半的曝光时间。所以在采用W-View GEMINI配合Flash 4.0 LT的时候，我们可以非常灵活地调整两个颜色信号的相对亮度，得到更加能够突出所需信号和结构的图片。在两个颜色通道的信号差别非常大的时候，Flash 4.0 LT + W-View GEMINI这种灵活的曝光时间设置就可以针对不同的波长设置不同的曝光时间，同时保证两个波长信号的信噪比。

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W-View GEMINI应用实例1——表达Cameleon (YC3.60)的HeLa细胞在收到组胺刺激时的高速钙离子成像

物镜：100x，NA 1.49	帧速：33.3 帧/秒
相机：滨松ImageEM X2 EMCCD	曝光时间：30 ms
附件：滨松W-View GEMINI	增益：1200x

在细胞内钙离子浓度高速变化的场合下，双色同步成像可以保证数据的高速采集。以这个实验为例，YC3.60的分子中包含CFP、YFP两个部分，没有钙离子结合时，两个部分距离较远，用430nm的光激发时得到的是CFP所发射的480nm的青色信号；当结合了钙离子之后，YC3.60中CFP和YFP两个部分在分子中会挨到一块儿，符合CFP-YPF发生FRET的条件，430nm激发光照射时，能量将由CFP转移至YFP，发射出535nm的黄色荧光信号。所以通过实时检测480nm和535nm的信号强度比值就可以监测细胞内钙离子的浓度。

如果采用滤光轮，假设不同滤光片位置的切换时间为30ms（这已经是比较出色的产品了），CFP和YFP各自需要30ms曝光时间，一个数据点需要切换两次滤光片位置（如从CFP切换到YFP然后还得切换回来预备下一个数据点的采像），所以总共需要120ms来采集一个数据点，结果就是当我们采用滤光轮的配置时每秒钟我们只能得到8-9个数据点（钙离子浓度数据）。

而采用W-View GEMINI时，30ms的曝光时间内就可以同时采集到CFP和YFP的荧光信号，而且没有颜色切换的时间损失，最终保证了33帧/秒的高速成像，也就是说，每秒钟我们可以得到33个钙离子浓度数据点。

两种方法在动力学上的表现高下立判。

W-View GEMINI应用实例2——采用Di-4-ANEPPS对hiPS-心肌细胞的膜电位变化进行成像

物镜：100x，NA 1.49	帧速：100 帧/秒
相机：滨松Flash 4.0 V2 sCMOS	曝光时间：10 ms
附件：滨松W-View GEMINI	发射波长：525/50 nm & 630/92 nm

对于样品有位置移动的情况下，双色同步成像可以抵消样品位置变化所造成的误差。

比如这个例子中的诱导心肌细胞，我们需要通过Di-4-ANEPPS这个染料对其膜动作电位进行成像。Di-4-ANEPPS这种荧光染料通过蓝光（~488nm）激发，其发射波长却会根据膜电位而有所变化，通过计算细胞不同区域内525nm/630nm的比值就可以得到此区域内膜电位的变化。这种成像方法相相对膜片钳等电生理方法而言，可以得到细胞任意位置的膜电位变化，空间分辨率更高。而W-View GEMINI双色分光附件以及高速高灵敏度的Flash 4.0 sCMOS相机的应用也保证了其极高的时间分辨率（每秒100个数据点），使得我们可以对细胞任意位置的动作电位进行时间空间都非常精确的测量。

W-View GEMINI应用实例3——线虫盐敏感（salt-sensing）神经元在NaCl浓度变化时响应的时空关系分析

物镜：60x，oil	帧速：30 帧/秒
相机：滨松Flash 4.0 LT	曝光时间：33 ms
附件：滨松W-View GEMINI	探针：ASER-R-GECO1_AIY-G-GECO1.2

在这个例子中，为了监测ASER和AIY两个神经元在外界NaCl浓度变化时的表现，研究者分别在两个神经元上表达标记了红色和绿色的钙离子敏感荧光蛋白R-GECO1与G-GECO1.2，然后让环境中的NaCl浓度以10秒为周期在0mM和50mM之间切换。通过分析两个神经元内钙离子的浓度变化，可以看出两个神经细胞两者在NaCl不同浓度下的相反表现。

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双色同步成像在荧光共定位等成像实验中的应用（二）

周锦帆