【干货】如何选择合适的代谢组学分析技术

沃特世

2018.12.06

《岳阳楼记》中对洞庭湖有“沙鸥翔集，锦鳞游泳”的描述，如此美丽的美景，让人流连忘返。我们也许并未想过沙鸥在水面上的“翔集”并非偶然，而是与水面下的“游泳”的锦麟的动向是高度关联的。

如果用代谢组学的思想对其进行分析，这种相关性就相当于代谢组学中的Scores plot，并可得到水面为界的两种动物的Clusters。Clusters的数量越多、质量越高，我们对这种相关性的描述越客观、越全面，而Clusters数量和质量的高低取决于所用的分析技术。

目前代谢组学研究的主要技术为核磁共振和质谱技术。

核磁共振的优势在于生物样本的微量和无损检测，以及组织样本的原位检测，而其最大的研究瓶颈在于灵敏度较差。

质谱技术相对于核磁共振技术而言，具有高选择性和高灵敏度，能够同时检测多种代谢物，应用范围极广，同时可以很方便地与分离技术如气相色谱、液相色谱及超临界流体色谱等结合，进一步提高分离复杂样品代谢组的能力。

接下来我们来谈谈可以与质谱联用的应用于代谢组学研究的分离技术。

超高效液相色谱 — UPLC

UPLC自2004年推出以来凭借着高超的分离能力和高通量的分析能力，成为了各实验室的首选色谱分离仪器，尤其在高通量的组学领域的应用，更是不可或缺。

早在2006年，Anders Nordstrolm等就在Analytical Chemstry发表了一篇文章，就HPLC和UPLC的色谱分离能力进行了比较。

该研究采用同一套LC-QTof/MS仪器，仅通过采用不同粒径的色谱柱去验证HPLC（3.5 μm）和UPLC（1.7 μm）的分析结果。实验结果表明，相对于HPLC，UPLC技术在人血清中多鉴定出了20%的组分，且具有更高的峰容量，更小的离子抑制及较好的信噪比等，为数据发现、整合及进一步的评估提供了更好的基础。

目前，基于UPLC-MS的代谢组学分析方法已经被研究者广泛使用，比如，Changhao Sun等人采用UPLC-MS方法、非靶向代谢组学技术对单纯餐后糖尿病患者、新诊断的2型糖尿病患者和健康人的血清样本进行分析，找到15种相关的代谢物（亚油酸、油酸、磷脂和脱氢表雄酮硫酸盐等），见图1。

图 1. 采用UPLC-MS方法在血清样本中找到的重要代谢物

气相色谱 — APGC

常规的GC-MS，由于其电离源EI源自身电离原理的限制，仅能通过 “碎片离子”去解析数据，假阳性率高，特别是复杂成分中的衍生化合物的分析，由于缺少分子离子峰的信息，在结构鉴定上更是困难重重，极大可能存在匹配错误的现象。

APGC作为一种软电离技术，可以产生很强的分子离子峰。当APGC串联QTof/MS时，再结合MS^E技术，即可得到复杂成分中每一个化合物的母离子和碎片离子信息。

比如，APGC-QTof/MS对拟南芥野生型和突变型植物提取物进行分析。结合MS^E技术，在低碰撞能下得到的某一成分，比如苹果酸的分子离子峰及在高碰撞能下得到的碎片离子峰，如图2A。且经过调整后的碰撞能下得到的碎片离子质谱图与NIST谱库中的EI数据类似，如图2B。

图 2. A)在MS^E模式下，衍生化苹果酸的低碰撞能和高碰撞能条件下的质谱图；B）从NIST谱库得到的衍生化苹果酸的EI质谱图

超高效合相色谱 — UPC²

超高效合相色谱（Ultra Performance Convergence Chromatography,UPC²）利用超临界流体色谱的技术原理，基于沃特世公司已成熟的UPLC硬件/软件技术平台，针对超临界流体的特性进行优化设计，突破了原有超临界流体色谱的技术瓶颈（如系统压力波动大、低比例助溶剂传输精度低、灵敏度低等），为分析研究工作者提供了一种全新的分析工具。

在临床研究中，脂类水平作为不同疾病的生物标志物，还可衡量治疗的疗效。其中游离脂肪酸的分析通常用GC-MS，但需要将其衍生为脂肪酸甲酯以改善峰形和检测限，衍生需要数小时，且分析时间长达30 min。对于磷脂和鞘脂类等极性强的脂质来说，通常需使用HILIC或正向LC来分离不同的脂质种类（基于极性头部基团的属性）。然后再根据碳链长度和/或双键数量的不同，使用反相LC对同种类的强疏水性脂质进行分析。完整的脂质分析需使用多种技术，但有了UPC²，只需一种技术即可分析所有种类的脂质。

图 3A：小鼠心脏提取物在配备MS检测器的ACQUITY UPC²系统上的综合脂质分析图谱。（应用文献：使用UPC²/MS系统对脂质类进行分离）

对于中性脂质（如TG、DG、CE以及FFA），只需改变色谱柱和梯度条件即可根据脂肪酸碳链长度以及双键数量的不同保留并分离同一种类中不同的脂质（图3B）

图 3B：使用配备MS检测器的ACQUITY UPC²系统对游离脂肪酸（FFA）、三酰甘油（TG）和胆固醇酯（CE）进行靶向分析

另外，Hiroaki Takeda等人采用UPC²-MS技术在兔子血浆中分离检测到了22种脂类（LPC,LPE,LPG,LPA,LPI,LPS,PC,alkyl-acyl PC, alkenyl-acyl PC,PE, alkyl-acyl PE,PG,PA,PI,PS,SM,Cer,CE,MAG,DAG,TAG和FFA），包括一些位置和结构异构体。

总之，化合物性质不同，所需要的色谱分析技术也不一样。根据需求选择合适的分析技术，就可以便捷地分析检测我们感兴趣的化合物了。