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用辣根过氧化物酶标记的试剂进行间接检测

2020.9.21

实验概要

间接法是用未标记的一抗和标记有辣根过氧化物酶(HRP)的二级试剂，经过简单孵育后，进行酶促反应。将抗体直接加入细胞中就可以使一抗与细胞上的抗原结合，在加入不同抗体或同一抗体不同稀释度的溶液时，注意不要发生交叉污染，每一张盖玻片或样品管只能用于某一抗体溶液。抗体能够与相应抗原发生特异性结合，而未结合的抗体通过洗涤被去除，然后加入HRP标记的二级试剂，再经过洗涤后HRP酶促反应将在抗原—抗体结合的部位产生棕色沉淀。

实验原理

HRP标记的二级试剂通常用于低分辨率的研究，它可快速检测抗原的存在及位置。其主要优点为敏感性高、仅需光学显微镜即可观察等。

用于标记二级试剂的酶及其底物有数十种。考虑到价格，建议使用HRP及DAB来进行细胞染色。经过较长时间的孵育，HRP酶促反应作用强且呈线性变化。在多数可选底物中，DAB是最常用于HRP标记的试剂，而且也最为敏感。反应产物为深褐色，亦不溶于水和乙醇中。在底物溶液中加入钴、镍等金属盐可提高此法的敏感性，其反应产物为灰蓝色到黑色，亦不溶于水和乙醇中。这种产物易于照相或扫描，以便用于实验结果的保存和发表。

使用HRP酶标试剂时，稀释缓冲液及洗涤液均不应含有叠氮钠，因为即是微量的叠氮化合物也能灭活HRP酶的活性。一抗中加入的叠氮钠在经过洗涤后由于得到充分稀释，一般不会影响到后续的酶活性检测。

主要试剂

一抗溶液；二抗溶液(多为商品化的HRP标记的抗Is抗体)；3％BSA／PBS；DAB；0.05mol/LTris缓冲液；0.3％mg／ml氯化镍储存液，溶于蒸馏水中；30％H₂O₂；DPX。

主要设备

光学显微镜(带有照相机以记录结果)。

实验步骤

1. 对照

每个实验至少需设两组对照：①加入同一种属、同一类型的无关抗体作为一抗以检测染色的特异性；②对照组不加一抗以检测标记二抗的背景；③如有可能，还应设置阳性对照。

2. 准备工作

进行抗体结合和检测最重要的准备工作是一抗和二抗的滴度测定。虽然在下述技术方法中建议抗体的初始加入量，但在免疫染色中最大的问题是调整一抗、二抗的加入量使之产生有效信号，又避免非特异性染色。最好的办法是对每一种抗体(存在于蛋白质缓冲液中，如3％BSA／PBS)作一系列稀释并观察其对靶细胞的效应。l／3稀释(1份体积中加入2份体积)将接近半对数期，能迅速合理地确定抗体加入的量。每次准备一抗时，都需重复滴度测定实验。然而，一旦确定了二级试剂的稀释度，就可以作为这一批抗体的标准。

操作步骤：

3. 将盖玻片、载玻片或培养板置于水平面上；如为1h或1h以下的短程孵育，则勿需湿孵，可将盖玻片或载玻片直接放置在实验台上。多个盖玻片则需置于Parafilm膜上，因为Parafilm膜有弹性，能够防止抗体溢出盖玻片边缘，也便于镊子操作。但如果圆形盖玻片数量过多，最好将其置于细胞生长与固定的24孔培养板中。

如果孵育时间>1h，则需将其置于培养皿或湿盒中以利湿孵。有几种方法可供放置盖玻片或载玻片选用，以便于操作和湿孵，可依具体情况选用。例如，在培养皿上铺一层水饱和的滤纸，再将载玻片置于滤纸上。盖玻片亦可经类似处理。如用24孔培养板，则需在板盖上铺一层潮湿的滤纸来保持湿度。

如孵育时间超过1h，可将抗体溶液加在Parafilm膜上的玻片上，再将盖玻片或载玻片(样品面朝-F)盖在抗体溶液上。孵育完毕后用PBS洗涤。

4. 加入一抗：加入足够量的一抗使其覆盖细胞，但不要溢出盖玻片或载玻片边缘，通常加入iotA。所有稀释液必须用蛋白质溶液配置，如3％BSA／PBS；

单克隆抗体通常为组织培养上清液(特异性抗体浓度为20～50ug／m1，未稀释)。腹水、纯化的单克隆和多克隆抗体以及粗制的多克隆血清应该进行稀释度测定。如果特异性抗体的浓度是未知的，应测试初始样品的不同稀释度(1：10，1：100，1：1 000，1：10 000)。

5. 盖玻片、载玻片或平皿的孵育，在室温下至少30 min。超过30 min则需湿孵或采用步骤3所述的方法。对于某些反应，将孵育时间延长至12h，能够提高实验的灵敏度；

6. PBS洗3次，每次5min以上；

PBS缓冲液中可以含1％TritonX-100或NP-40，以帮助解决背景问题。

7. 加入HRP标记的抗Ig抗体。这些试剂应购于有良好信誉的商业试剂公司。确认所选择的二抗是特异性针对一抗的种属来源。例如，一抗如果来源于兔，则羊抗兔Ig将是一个很好的选择。二抗应该用含蛋白质的溶液(如3％BSA／PBS)进行稀释。供应商会建议合适的稀释度，但如果没有相关建议，可进行二抗稀释度测定，稀释度范围在1：10和1：1 000之间。

加入稀释液的竞争蛋白必须为非特异性抗体，其来源应与标记二抗一致，即同一种属的动物。例如，如果使用标记的羊抗兔Ig，则稀释液中须含1％的非免疫羊18(从非免疫动物中分离及纯化)。

8. 加入标记的二级试剂后在室温下孵育至少20min，但不应超过1h；

9. 用PBS洗3次，每次5min以上。

10. 最后一次洗涤时，准备底物DAB。将6mgDAB溶于10ml 0.5mol／LTris缓冲液中(pH 7.6)，加lml 0.3％W／V的氯化镍储存液(或等量的氯化钴)；加0.1ml的3％H₂O₂溶液。30％H₂O₂溶液较易获得，可置4℃保存1个月；

如出现沉淀，用Whatman 1#滤纸(或类似滤纸)过滤；

11. 将底物溶液加入样品。观察样品，在背景发生变化前出现适量黑色沉淀时终止反应。常为1～20min之间。在水中漂洗数次即可终止反应

12. 加入DPX，用光学显微镜观察结果。

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