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三代测序的DNA提取和宏基因组学分析（一）

2021.7.08

改进的人类肠道微生物组的高分子量DNA提取，纳米孔测序和宏基因组学装配

Improved high-molecular-weight DNA extraction,
nanopore sequencing and metagenomic
assembly from the human gut microbiome

Nature Protocols [IF: 10.419]

DOI：https://doi.org/10.1038/s41596-020-00424-x

发表日期：2020-12-04

第一作者：Dylan G. Maghini¹

通讯作者：Ami S. Bhatt
(asbhatt@stanford.edu)^1,2

合作作者：Eli L. Moss,Summer E. Vance

主要单位：

¹美国斯坦福大学遗传学系(Department of Genetics, Stanford University, Stanford, CA, USA)

¹美国斯坦福大学医学系(Divisions of Hematology and Blood & Marrow Transplantation, Department of Medicine, Stanford University, Stanford, CA, USA)

写在前面

分享标题：Nature 子刊：三代测序的DNA提取和宏基因组学分析

关键字：宏基因组学，生物信息学，文库制备，长读长测序，人类肠道菌群，高分子量DNA

摘要

人类肠道菌群的短读长宏基因组测序和从头基因组组装无需分离和培养即可获得细菌基因组草图。然而，由短读长测序组装的细菌基因组通常是片段化的。此外，这些由宏基因组组装的基因组通常不包括重复的基因组元件，例如移动遗传元件，从而损害了我们对这些元件对重要细菌表型贡献的理解。虽然长读长测序已成功应用于连续细菌分离基因组的装配，但从粪便样本中提取足够分子量、纯度和数量以进行宏基因组测序的DNA可能具有挑战性。在此，我们提出了一种从人类粪便样本中提取微克量的高分子量DNA的方法，该方法适用于下游长读长测序的应用。我们还介绍了Lathe (www.github.com/bhattlab/lathe)，这是一种用于长读长碱基识别、组装、长读长和Illumina短读长的校对和基因组环化的计算工作流程。总而言之，此方法可以在大约10天内，包括2天的实验操作和计算下从复杂的人类肠道样本中产生高质量的连续或环状细菌基因组。

步骤概述

在这里，我们描述了从人粪便样品中提取高分子量(HMW)DNA的改进方案(图1)，以及对测序方法的建议以及用于长读长数据的宏基因组组装/拼接的工作流程(图2)。具体来说，我们描述了用于酶促细菌细胞裂解(步骤2-4)，RNA和蛋白质消化(步骤7)，样品纯化(步骤8和9)和DNA片段选择(步骤13-15)的方法以及我们针对长读长组装软件、抛光方法和错误校正的建议。浓缩DNA的提取方法见补充说明1。

图 1 高分子量DNA提取工作流程

High-molecular-weight DNA extraction workflow

翻译如下图

最好使用带柱塞的活检打孔器将冰冻的粪便等分，并特别注意刀刃。将粪便分成等份试样后，DNA提取工作流程将继续进行样品悬浮，酶解和化学裂解以及DNA纯化。Qiagen Genomic-tip是一种基于色谱柱的纯化方法，旨在最小化DNA的剪切。使所有试剂在重力作用下流过基因组尖端色谱柱；请勿使用注射器或真空泵抽液，因为这会损坏色谱柱。提取DNA后，选择大片段以使用在定制缓冲液中制备的SPRI珠子。应分别使用Qubit荧光计，NanoDrop分光光度计和Agilent TapeStation评估提取的DNA的浓度，污染情况和大小分布。DNA被提取并达到质量阈值后，可以通过文库制备方法进行纳米孔测序。EtOH-乙醇。

图 2 测序后生物信息学分析工作流程

Post-sequencing bioinformatic workflow

翻译如下图

测序完成后，在使用Flye或Canu组装软件进行组装之前，使用计算组装工作流程(步骤25)对原始纳米孔信号进行碱基识别。然后，工作流程提供了可选的修饰步骤，方法是将短或长读长与组装片段比对，并用比对读长的共有碱基(橙色)校正单个核苷酸错误和插入缺失(绿色)。最后，工作流用于通过自我对齐和修剪或末端重叠群的装配来执行环化步骤。

dna提取三代测序

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